Plan du cours 1. Introduction 2. L’eau 3. Les acides aminés, les peptides et les protéines 4. La structure tridimensionnelle des protéines 5. Exploration des protéines 6. La fonction des protéines 7. Les enzymes 8. Les glucides 9. Les nucléotides et les acides nucléiques 10. Les technologies de l’ADN 11. Les lipides 12. Les membranes biologiques et le transport 13. La signalisation cellulaire 14. Cancer et apoptose

10. Les technologies de l’ADN 10-1

10.1. PCR RT-PCR 10-2

10.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) 10-3 Kary Mulis, 1985 Prix Nobel de chimie en 1993 Amplification d’un segment particulier d’ADN (x 10 9 ) Très sensible (1 seule molécule d’ADN dans un échantillon) Ex. Mise en évidence de l’ADN du HIV Introduction

Principe Répétition d’une même réaction (20-30 cycles, x 2 à chaque cycle) Premier cycle Polymérase Taq provient d’une bactérie thermorésistante, Thermus aquaticus 95°C 54°C 72°C Voir dias 9.44 et 9.45

10-5 Machine PCR

10-6 Cycles suivants

10-7 Visualisation de l’ADN amplifié Produit PCR Migration sur gel d’agarose Visualisation des bandes d’ADN amplifié (gel dans un bain contenant du bromure d’éthidium) Ex. HIV Marqueur de taille

Intérêts Diagnostic des maladies infectieuses Ex. maladies humaines: HIV, Tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) … Ex. maladies vétérinaires: Virus: CT: FIV, PIF, FHeV, Calicivirus, panleucopénie,… CN: Parvovirose, maladie de Carré,… Bactéries: CT: Bartonella, mycoplasma, chlamydia,… CN: Bartonella, leptospirose,… Parasites: CT: Toxoplasma,… CN: Babesia,…

10-9 Médecine légale Séquence microsatellite hypervariable (ex. CACACAC…) = VNTR (nombre variable de répétition en tandem)

10-10

10-11 Archéologie, paléontologie et épidémiologie moléculaire Ramsès II Momies péruviennes Tuberculose HTLV-1

10-12 Séquençage On veut connaître la séquence du segment d’ADN amplifié par PCR Isolement et purification du segment d’ADN Séquençage (méthode de Sanger) Intérêts: 1.Séquençage du génome (Human Genome Project, +/ gènes, 2001). Séquençage du génome des animaux domestiques terminé pour de nombreux animaux. 2.Mise en évidence des maladies génétiques (ex. Mucoviscidose chez l’homme, voir dia 4.28 et 4.29)

PCR RT-PCR

RT-PCR (Reverse transcription PCR) Amplification d’un ARN messager particulier Mise en évidence de l’expression d’un gène particulier Ex. Oncogènes (ex. c-kit dans les tumeurs mammaires malignes du chien) Introduction Transcriptase inverse (rétrotranscriptase) ARN réplicase (ou synthétase) (ex. Influenza) Transcriptase inverse (ou rétrotranscriptase) (ex. HIV) ARN polymérase Rappel (dia 9.3)

10-15 Utilisation de la transcriptase inverse par les rétrovirus (ex. HIV) Découverte de la transcriptase inverse en 1970 par Temin et Baltimore Prix Nobel en 1975

RT-PCR: principe 1. Production d’un ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARNm 2. PCR Transcriptase inverse