Méthodes de séparation analytique: Chromatographie chirale Beauverd Luc et Drissi Hedi 31.01.2005

Rappel: Qu’est-ce que la chiralité? INTRODUCTION Rappel: Qu’est-ce que la chiralité?

CHIRALITE Définition: propriété de ne pas être superposable à son image dans un miroir. Chaque carbone asymétrique est un centre de chiralité. - Propriété physique associée à la chiralité : une substance chirale est douée d'activité optique et fait tourner le plan de polarisation d'une lumière polarisée plane qui la traverse. - Propriétés physico-chimiques des énantiomères: identiques hormis leur action sur la lumière polarisée.

CHIRALITE Définition: propriété de ne pas être superposable à son image dans un miroir. Chaque carbone asymétrique est un centre de chiralité. - Propriété physique associée à la chiralité : une substance chirale est douée d'activité optique et fait tourner le plan de polarisation d'une lumière polarisée plane qui la traverse. Propriétés physico-chimiques des énantiomères: identiques hormis leur action sur la lumière polarisée. => SEPARATION TRES DIFFICILE PAR LES PROCEDES CHIMIQUES HABITUELS !

CHIRALITE Exemple: le butan-2-ol S-butan-2-ol R-butan-2-ol

Enantiomères / Diastéréoisomères CHIRALITE: Enantiomères / Diastéréoisomères

CHIRALITE Importance de la chiralité: Simplification du grand nombre de possibilités de synthèses. Exemples: production de D-glucose (et pas un mélange des 15 autres hexoses possibles), production d’acides aminés L uniquement (et pas du mélange D et L). - Vaste domaine d’utilisation dans les différentes industries chimiques.

APPARITION DE LA CHROMATOGRAPHIE CHIRALE Première séparation d’énantiomères: Pasteur en 1848. - Principal essor: années 1970 – 1980.

IMPORTANCE DE LA SEPARATION DES MOLECULES CHIRALES → Propriétés pharmacologiques des stéréoisomères peuvent être très différentes. Exemple: stéréosélectivité dans l’action des médicaments.

CHROMATOGRAPHIE CHIRALE Développement de procédés chromatographiques spécifiques ont permis séparation des molécules chirales Chromatographie chirale à Rancho Cardova (Californie)

CHROMATOGRAPHIE CHIRALE 2 types de séparation: Mode direct: soit phase stationnaire chirale, soit additif chiral dans la phase mobile.

CHROMATOGRAPHIE CHIRALE 2 types de séparation: Mode direct: soit phase stationnaire chirale, soit additif chiral dans la phase mobile. Mode indirect: réaction chimique préalable entre un réactif chiral et deux énantiomères pour former des diastéréoisomères séparables sur les phases stationnaires habituelles.

TYPES DE CHROMATOGRAPHIE CHIRALE - Chromatographie en phase liquide - Chromatographie en phase gazeuse - Chromatographie en phase supercritique

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE Avantage par rapport à la GC: ne requiert pas de températures élevées risquant de dégrader les composés ou d’entraîner leur racémisation.

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Phases stationnaires: possèdent un sélecteur chiral pour lequel l’affinité vis-à-vis des énantiomères est différente.

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Phases stationnaires: possèdent un sélecteur chiral pour lequel l’affinité vis-à-vis des énantiomères est différente. ceci permet une rétention selon le principe “qui se ressemble s’assemble”

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Phases stationnaires: possèdent un sélecteur chiral pour lequel l’affinité vis-à-vis des énantiomères est différente. ceci permet une rétention selon le principe “qui se ressemble s’assemble” Sélectivité expliquée par la règle des trois points de Dalgliesh: 3 points d’intéraction entre le sélecteur chiral et l’énantiomère.

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Phases stationnaires: possèdent un sélecteur chiral pour lequel l’affinité vis-à-vis des énantiomères est différente. ceci permet une rétention selon le principe “qui se ressemble s’assemble” Sélectivité expliquée par la règle des trois points de Dalgliesh: 3 points d’intéraction entre le sélecteur chiral et l’énantiomère. Cause de ces intéractions: énergies d’association énantiomère/phase stationnaire étant différentes.

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Phases stationnaires: possèdent un sélecteur chiral pour lequel l’affinité vis-à-vis des énantiomères est différente. ceci permet une rétention selon le principe “qui se ressemble s’assemble” Sélectivité expliquée par la règle des trois points de Dalgliesh: 3 points d’intéraction entre le sélecteur chiral et l’énantiomère. Cause de ces intéractions: énergies d’association énantiomère/phase stationnaire étant différentes. Phases de silice greffées de sélecteurs chiraux par l’intermédiaire de bras espaceurs spécifiques.

Différents types: Type I: CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type I: Phase stationnaire: acide aminé immobilisé sur groupement 3-amino propysilyl retenu sur silice:

Différents types: Type I: CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type I: Phase stationnaire: acide aminé immobilisé sur groupement 3-amino propysilyl retenu sur silice: Principe: Le groupement dinitrobenzoyle favorise les intéractions par transfert de charge. Le groupement amide peut établir en fonction de son orientation stérique des liaisons secondaires spécifiques avec l’un des deux énantiomères. (interactions dipôle-dipôle, liaisons H, intéractions “hydrophobes”). Utilisation: Séparation des énantiomères hydroxylés ou aminés, principes actifs de nombreux médicaments: phase type Pirkle.

Type II: Phase stationnaire: cyclodextrines ou éthers courone: CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type II: Phase stationnaire: cyclodextrines ou éthers courone:

Type II: Phase stationnaire: cyclodextrines ou éthers courone: CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type II: Phase stationnaire: cyclodextrines ou éthers courone: Principe: Inclusion réversible des énantiomères dans leur cavité lipophile: Sur β cyclodextrines: Rétention régie par l’inclusion ou non du centre chiral, la taille, l’encombrement stérique des molécules, la formation de liaisons secondaires spécifiques et la stabilité des associations formées. Sur éthers couronnes: établissement de liaisons H avec les protons des groupements amine ou hydroxyle. Utilisation: Séparation des stéréoisomères des amines primaires, des aminoalcools et des acides aminés.

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type III: Phase stationnaire: phases polymériques à base de polysaccharides (cellulose, amylose) ou de polyacrylamides possédant des centres d’asymétrie

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type III: Phase stationnaire: phases polymériques à base de polysaccharides (cellulose, amylose) ou de polyacrylamides possédant des centres d’asymétrie Principe: Sur cellulose: inclusion énantiosélective vis-à-vis de molécules ayant des groupements polaires, par sa structure hélicoïdale. Phase mobile: phase normale; mélange d’hexane et d’alcool. Utilisation: Séparation de molécules possédant des groupements polaires.

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type IV: Phase stationnaire: protéines (glycoprotéines, sérum albumine, orosomucoïdes) immobilisées sur silice:

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 1) Utilisation de phases stationnaires chirales: Différents types: Type IV: Phase stationnaire: protéines (glycoprotéines, sérum albumine, orosomucoïdes) immobilisées sur silice: Principe: Nombreux sites de liaison, favorables aux intéractions lipophiles et électrostatiques et à leur configuration structurale. Utilisation: Séparation de molécules polaires rencontrées dans les milieux biologiques (métabolites et biomolécules).

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 2) Utilisation de phases mobiles avec additif chiral: Pour énantiomères à caractère ionique: par addition de composés chiraux, formation préférentielle d’une paire d’ions avec un énantiomère.

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 2) Utilisation de phases mobiles avec additif chiral: Pour énantiomères à caractère ionique: par addition de composés chiraux, formation préférentielle d’une paire d’ions avec un énantiomère. Addition aux énantiomères de composés se prêtant à l’inclusion stéréospécifique d’un des énantionmères. Exemple:

SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE DIRECT (SANS DERIVATION) 2) Utilisation de phases mobiles avec additif chiral: Pour énantiomères à caractère ionique: par addition de composés chiraux, formation préférentielle d’une paire d’ions avec un énantiomère. Addition aux énantiomères de composés se prêtant à l’inclusion stéréospécifique d’un des énantionmères. Exemple: Phase stationnaire: phase achirale.

SEPARATION EN MODE INDIRECT PAR FORMATION DE DERIVES CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE SEPARATION EN MODE INDIRECT PAR FORMATION DE DERIVES Transformation préalable des énantiomères en diastéréoisomères par réaction avec un réactif chiral. Séparation sur des colonnes pouvant être chirales ou sur des colonnes achirales présentant en général un nombre de plateaux supérieur aux colonnes chirales. → Dérivation à température ambiante pour éviter la racémisation !

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE Sur colonnes capillaires Exemple: Application: composés volatils racémiques Principe: interactions dipôle-dipôle, forces de dispersion et forces électrostatiques pouvant entraîner liaisons soluté/phase stationnaire. Diminution de la température (si possible), permet de meilleures énantiosélectivités.

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE Deux types principaux de phases stationnaires: Phases stationnaires à base d’aminoacides: obtenue par copolymérisation et greffage de méthyl alkyl ou cyano alkyl éthyl polysiloxanes avec des monoamides ou diamides d’aminoacides optiquement actifs:

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE Deux types principaux de phases stationnaires: Phases stationnaires à base d’aminoacides: obtenue par copolymérisation et greffage de méthyl alkyl ou cyano alkyl éthyl polysiloxanes avec des monoamides ou diamides d’aminoacides optiquement actifs: Phases stationnaires à base de cyclodextrines: parmi ces phases, on distingue les phases à caractère lipophile, à caratère hydrophile ou à caractère intermédiaire. La dimension de la cavité d’inclusion et le pourcentage de cyclodextrine interviennent dans la séparation.

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE Mécanismes de rétention identiques à ceux de la chromatographie liquide Séparations plus rapides Température intervient très fortement sur l’énantiosélectivité Phases stationnaires: identiques à celles mises en oeuvre en chromatographie liquide

DOMAINES D’APPLICATION Industrie pharmaceutique Industrie agrochimique Industrie alimentaire - Industrie pétrochimique

REFERENCES G. Subramanian, A Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography, VCH, 1994 S. Ahuja, Chiral Separations by Liquid Chromatography, ACS, 1991 M. Zief, L. J. Crane, Chromatographic Chiral Separations, Marcel Dekker, 1988 M. Krstulovic, Chiral Separation by HPLC, British Library, 1989 http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_sur_phase_chirale http://www.geocities.com/CapeCanaveral/8775/chiral.html

FIN…