Les Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) Définition Fonctions / développement embryonnaire Niche et motilité CSH en thérapies Matthieu ROULEAU, PhD INSERM U898 (Faculté de Mèdecine) rouleau@unice.fr

Qu’est-ce qu’une cellule souche? Quelle est sa fonction au sein d’un tissu ou d’un organe ? Une cellule souche va assurer: l’homéostasie à long terme du tissus/organe Maintien tout au long de la vie de l’individu de la fonction du tissu/organe la réparation du tissus en cas de lésion

Qu’est-ce qu’une cellule souche? Une cellule souche possède les caractéristiques uniques de: s’auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée se différencier c’est à dire produire différentes cellules spécialisées (différenciées) Notion de Plasticité

Différents niveaux de plasticité Totipotence : capacité à générer toutes les cellules d’un organisme (y compris le tissu extra-embryonnaire) pour former un être vivant structuré multicellulaire = œuf fécondé Pluripotence : capacité à générer toutes les cellules d’un organisme = les cellules souches embryonnaires (ES) Multipotence : capacité à générer certaines cellules constitutives d’un organe = cellules souches adultes tissulaires Unipotence : capacité à générer un seul type de cellules = progéniteurs unipotents (maturation fonctionnelle d’une cellule)

Les différent types de cellules souches iPS cell (cell. Souches Pluripotentes induites) Prolifératives Lignées cellulaires Quiescentes, Faible nombre Accès difficile Culture difficile Difficiles à étudier

Caractéristiques typiques des cellules souches tissulaires Auto-renouvellement : division cellulaire qui engendre au moins une cellule fille qui conserve le potentiel souche Multipotence : capacité à engendrer des cellules progénitrices de tous les types cellulaires composant le tissus Caractéristiques clefs pour assurer l’homéostasie/le renouvellement du tissu/réparation tissulaire Quiecence in vivo, mais parfois fort taux prolifératif in vitro Notion de holo-, méro- et para-clones (Barrandon & Green PNAS 1985) Très faible nombre in vivo Absence de marqueur spécifique Cellules difficiles à analyser Notion de « niche » une structure responsable du maitien de la CS dans un état de non différenciation

Les différent types de cellules d’origine hématopoiétique

Facteurs de croissance: Auto-renouvellement Cellules souches multipotentes Progéniteurs: Cellules Précurseurs: cellules engagées différentiées quiescentes prolifératives CSH CD34+ CD19+ CD4+ CD8+ CD41+ CD33+ CD38+ (0.003%) Multipotence progéniteur commun myéloide progéniteur commun lymphoide Facteurs de croissance: EPO ,TPO, G-CSF, GM-CSF, etc…. myélocytes eosinophiliques granulocyte monocyte myélocytes basophiliques 6 min cellule T cellule B globules rouges mégakaryocytes eosinophiles monocytes/ macrophages neutrophiles basophiles 1011 cellules/jours plaquettes

Irradiée (faible dose) 1961-63: Till et McCulloch identifient les ”CFU-S”: 1ère évidence de cellules multipotentes CFU-S: Colony-forming unit-Spleen Irradiation létale Moelle osseuse 8-12 jours Nodules (Cellules érythroïdes, granulocytiques, macrophages…) (rate) (1) Différenciation (3) Auto-renouvellement (partiel) MAIS CFU-S ≠ CSH car ne donnent pas de lymphocytes Moelle osseuse Irradiée (faible dose) 8-12 jours Cassures ADN (2) Clonogénicité

Facteurs de croissance: Auto-renouvellement Cellules quiescentes CSH Cellules souches multipotentes CD34+ Multipotence CD34+ progéniteur commun myeloïde Cellules prolifératives CFU-S Progéniteurs: Cellules multipotentes progéniteur commun lymphoïde CFU-GEMM Facteurs de croissance: EPO ,TPO, G-CSF, GM-CSF, etc…. CFU-Meg Précurseurs: cellules engagées myélocytes eosinophiliques granulocyte monocyte myélocytes basophiliques CFU-E 6 min CD38+ CFU-GM Cellules différentiées cellule T cellule B globules rouges megakaryocytes eosinophiles monocytes/ macrophages CD41+ neutrophiles basophiles CD4+ CD8+ CD19+ CD33+ 1011 cellules/jours plaquettes

Méthodes expérimentales de caractérisation des CSH Difficultés: 1) Absence de marqueurs spécifiques > combinaison de marqueurs 2) Différenciation spontanée et faible expansion des CSH in vitro CSH souris CSH homme CD34low/- Sca-1+ Thy1+/low CD38+ c-kit (CD117)+ Lignage- (14 marqueurs de diff.) CD34+ Thy1+ (CD90) CD38low/- c-kit-/low Lignage- (14 marqueurs de diff.)

3) Identification fonctionnelle a posteriori Detection des CFU: Colony forming unit

Test de reconstitution in vivo  Capacité à régénérer un système hématopoïétique complet à long-terme chez une souris irradiée Irradiation létale Survie (progéniteurs), Prise de greffe (% chimérisme) 2-5 mois 3) Transplantation en serie Seul test des CSH les plus pluripotentes!! Moelle osseuse/CSH Seule 1 sur 10 000 cellules de moelle osseuse possède cette capacité de reconstitution à long terme

(Cellules souches endo/hémato) Dévelopment embryonnaire des CSH Succession de sites pour l’hématopoïèse: 1) Le sac vitellin (extra-embryonnaire) Hémangioblastes (Cellules souches endo/hémato) Ilôts sanguins pas de CSH pluripotentes, érythrocytes primitifs, - ne participent pas à l’hématopoïèse adulte

2) La région aorte-gonade-mésonephros (AGM): 1er site des CSH CSH pluripotentes (faible nombre), Progéniteurs multipotents, pas de différenciation in situ - participent à l’hématopoïèse adulte 3) Le foie fetal: 1er site d’une hématopoïèse complete Colonization des CSH pluripotentes de l’AGM expansion des CSH (nombre définitif) différenciation importante Migration des cellules du foie vers: 4) Le thymus fétal 5) La rate fétale 6) La moelle osseuse fétale et adulte

LT-HSC = long term HSC ST-HSC = short term HSC CMP = Common Myeloid CLP = Common Lymphoid Progenitor Differentiated cells

Caractéristiques marquantes Cellules matures différenciées fonctionnelles Peuvent s’expandre temporairement mais continuent à se différencier Choix possible entre auto-renouvellement et differenciation Multipotence Auto-renouvellement Unipotence Pas d’auto-renouvellement

Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique Notion d’Auto-renouvellement Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique 2 cellules engagées 2 SC Division cellulaire symétrique Auto-renouvellement symétrique Différenciation symétrique Division cellulaire asymétrique SC Cellule engagée La division d’une cellule souche est asymétrique : les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère Maintien d’un nombre constant de cellules souches (SC)

Notion d’Auto-renouvellement Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique Division cellulaire symétrique Division cellulaire asymétrique SC Cellule engagée 2 SC Auto-renouvellement symétrique Expansion des CSH dans le foie fœtal; Reconstitution hématopoiétique après déplétion (chimiothérapie, …)

Les “niches” des cellules souches: des environnements ultra-spécialisés Follicule pileux Moelle osseuse Crypte intestinale Shofield (1978): 1) Site anatomiquement défini 2) Maintien des fonctions des CSH 3) Inhibition de la différenciation 4) Contrôle nombre de CSH 5) Capacité de réversion (?)

La “niche” des CSH dans la moelle osseuse Endosteum (Ostéoblastes Ostéoclastes)

Les constituants de la “niche” des CSH 1) Les cellules Ostéoblastes (sécretent SDF-1, contrôlent le nombre de CSH…) Cellules stromales (ex: cellules réticulaires) Cellules endothéliales 2) Facteurs solubles: Cytokines, hormones etc….. 3) Matrice extracellulaire : interface avec la matrice osseuse SDF-1/CXCR4

Différentes niches des CSH? Niche de quiescence Niche d’auto-renouvellement Niches fonctionnelles: Niche de quiescence, niche d’auto-renouvellement, niche de prolifération/différentiation? Niches anatomiques: Niche ostéoblastique et niche vasculaire? Niche d’auto-renouvellement

Les CSH et thérapies cellulaires 1- les transplantations 1) Restorer une fonction chez des patients avec mutations génétiques: Cancers du système hématopoïétique (leucémies) Maladies génétiques (immunologiques, métaboliques) > Allogreffe 2) Conserver et re-injecter les CSH saines après traitement: Tumeurs solides, Lymphomes ou certaines leucémies > Autogreffe

Maladies non-malignes Maladies malignes • Aplasies médullaires (Fanconi) • Déficits immunitaires combinés sévères • Hémoglobinopathies • Déficit enzymatique (Gaucher) • Autres (ostéopétrose) • Leucémies aiguës myeloïdes et lymphoblastiques • Leucémies myéloïdes chroniques • Syndromes myélodisplasiques • Lymphomes, Myélomes, • Leucémie lymphoïde chronique • Syndromes myéloprolifératifs • Tumeurs solides Allogreffe • Maladies auto-immunes • Maladies génétiques+ thérapie génique • Myélomes • Lymphomes non-hodgkiniens • Maladie de Hodgkin • Tumeurs solides (cancer du sein, neuroblastomes...) Autogreffe

3 propriétés fondamentales des CSH/progéniteurs pour la réussite de la greffe: La multipotence: Obtention de tous les types cellulaires hématopoiétiques 2) L’auto-renouvellement: Assure le maintien du système hématopoïétique reconstitué à long terme 3) La capacité de “homing” (domiciliation): Permet aux CSH de retourner dans la moelle osseuse après injection I.V. La présence des progéniteurs est importante pour la reconstitution à court-terme!

1ère évidence de cellules multipotentes CSH mobilisées par G-CSF 1961: Till et McCulloch: 1ère évidence de cellules multipotentes CSH mobilisées par G-CSF Eliane Gluckman, Paris E Donnall Thomas Alain Fisher, Paris CSH et thérapie génique Modèles expérimentaux Cellule souche leucémique

Sources de CSH en transplantation 1- Moelle osseuse (ponction sous anesthésie générale: 500-1200ml) 2- Sang périphérique par cytaphérèse (Cellules CD34+ mobilisées avec G-CSF: 0.05%  5%) 3- Sang de cordon ombilical Registre France Greffe de Moelle http://www.dondemoelleosseuse.fr

Etapes de la transplantation de CSH 1- Conditionnement (irradiation, chimiothérapie) Collecte des CSH du donneur (allogreffe) 2- Transfusion veineuse des CSH “Homing” vers la moelle osseuse 3- Traitement adjuvant Transfusion globules rouges, plaquettes Immunosuppression Antibiotiques, G-CSF Stockage des CSH du donneur “purge” éventuelle (autogreffe) 4- Reconstitutions hématologique (12 à 30 jours) et immunologique (1 an)

sang moelle osseuse Collecte de CSH (G-CSF) Migration/Trafficking des cellules CSH Situations physiologiques Mécanismes moléculaires Procédures médicales Homing / prise de greffe Greffe de CSH Très faible recirculation permanente à l’état normal (0.01% CD34+ dans le sang) sang moelle osseuse Mais ?? Mobilisation Collecte de CSH (G-CSF)

La chimiokine SDF-1 régule le homing des CSH cellule Mouvement Gradient de chimiokine SDF-1 CXCR4 (Chimiokines: cytokines chimioattractantes) La chimiokine SDF-1 régule le homing des CSH Cellules CD34+ Anti-SDF-1 Souris NOD/SCID Cellules CD34+ CD34 Anti-CD34 (CTL) CXCR4 Cellules CD34+ Anti-CXCR4 CFU-GM CFU-E CFU-GEMM moelle Test de détection des colonies humaines in vitro

Mécanisme de mobilisation des CSH?? 10 min Mécanisme de mobilisation des CSH??

G-CSF induit une réduction de SDF-1 dans la moelle osseuse Moelle osseuse (homme) Moelle osseuse (Souris) CTL SDF-1 20 4 15 3 CFC-C dans le sang (x103/ml) ( ) SDF-1 (ng/ml) ( ) 10 * 2 5 1 * * G-CSF CTL 1 jr 5 jrs G-CSF

Protéases neutrophiliques G-CSF Système nerveux Activation des ostéoclastes Protéases neutrophiliques Protéases ARNm SDF-1 protéine SDF-1 protéine SDF-1 Inhibition des ostéoblastes Diminution de SDF-1 dans la moelle osseuse Mobilisation des CSH/progéniteurs

Stratégies actuelles pour améliorer les transplantations Expansion du greffon Cytokines, Facteurs de croissance Sang Mobilisation GM-CSF AMD3100 (inhibiteur de CXCR4) Homing Expression de CXCR4 Inhibition de CD26 (qui dégrade SDF-1) Moelle osseuse Retention, Auto-renouvellement Activer signaux de la niche: parathormone (augmente ostéoblastes) Niche des CSH

Les CSH et thérapies cellulaires Réparation cardiaque (essais cliniques 2005- ) • Injectées au niveau de la lésion cardiaque après infarctus • Les CSH agissent en activant l’angiogénèse • Efficacité non encore démontrée CSH et thérapies géniques (essais cliniques 2000- )  Culture des CSH in vitro (cytokines) et transfert de gène (virus) Immunodéficiences (ADA-SCID, X linked-SCID, X linked-CGD) Maladies métaboliques Résultats: Bonne correction, Cellules T fonctionnelles MAIS: 4/10 enfants (Fisher, Paris) et 1/10 (Londres) ont développé des leucémies (LMO2) 1h

Les CSH et induction de tolérance  expériences limitées actuellement à des modèles animaux • utilisation de CSH “purifiées” (élimination des lymphoT contaminant pour éviter les problèmes de GVHD) allogéniques • transplantation de ces CSH (sans compatibilité de MHC et/ou de mHC)  Reconstitution d’un système hématopoiétique équivalent à celui du donneur • transplantation d’un organe solide issus du même donneur que les CSH Absence de rejet de ce greffon. Il y a eu induction de tolérance spécifique : Un greffon obtenu d’un donneur tierce sera rejeté.

Les CSH et induction de tolérance (suite) Gandy et al Transplantaion 1998 > 3000 CSH (H-2b) + cœur (H-2b) = pas de rejet > 6x106 cell de MO (H-2b) + cœur (H-2b) = pas de rejet 1h Transplantations contrôles : > 3000 CSH (H-2b) + cœur “tierce”(H-2k) = rejet à 100% > cœur (H-2d) tpl ds souris C57BL/Ka (H-2b) = rejet à 100%

Les cellules souches pluripotentes iPS Reprogrammation Induced pluripotent stem cells 1h45 Avantages: Cellules différentiées évite pb éthique hES autologues Problèmes à résoudre pour la thérapie: Utilisation de virus Protocoles de différenciation

Thérapie génique à partir de cellules iPS 2/2 2/2S A/T HbA HbSS Science, nov 2007 (1) Obtention de cellules iPS autologues (2) Correction du gène muté (recombinaison homologue) (3) Différenciation en cellules CSH (4) Transplantation des cellules CSH Gène muté Gène sain c-myc LoxP Anémie faciforme ou drépanocytose Mutation portée par une des chaine de l’hémoglobine.