BASES THEORIQUES DE LA FLUORESCENCE

E = h  = h C  (400-700) Visible 10-3 10-2 10-1 1 10 102 103 104 105 longueurs d’onde (nm) 10-3 10-2 10-1 1 10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010 g X UV IR mW TV, Radio Energie RMN, noyaux Espace cristallin Transition des electrons de valence Vibrations, rotations Rotations moléculaires

Longueur d ’onde  Energie Acides nucléiques A.a. aromatiques Pigments photosynthèse Porphyrines Longueur d ’onde  Energie

Principe physique de la fluorescence Etat Singulet relaxation vibrationelle Etat Triplet ISC La fluorescence est le résultat du retour à l’état fondamental d’une molécule à l’état excité par émission d’un photon absorption fluorescence Etat Fondamental relaxation vibrationelle

Energie kF F= S2 ki 1 F= = kF kci kF+kE+[Q].kQ+kj S1 kisc kF T1 Rendement quantique de fluorescence S2 ki Conversion interne F= = 1 kF kF+kE+[Q].kQ+kj Durée de vie de fluorescence kci Conversion intersystème S1 kisc kF T1 hF kci hA hP kp F 2 1 Phosphorescence Absorption Fluorescence

Paramètres mesurables - L’intensité de fluorescence F ou IF (en u.a. ou en équivalent QS) - Les longueurs d’onde max. lmax - Le rendement quantique de fluorescence F - La durée de vie de fluorescence F En pratique, on mesure IF à max

Energie S2 Conversion interne S1 Energie F 2 1 Absorption Fluorescence

Spectres d’excitation et d’émission de fluorescence 2 E S 1 Exemple : la fluorescéine S D.O F

La forme du spectre de fluorescence ne dépend pas de la longueur d’onde d’excitation

Rendement quantique de fluorescence fF Possibilités de désexcitations : S 1 k isc T 1 k f isc k a k i k f k ’ i k i S Cinétique : À l’état stationnaire : nombre de photons émis Rendement quantique = nombre de photons absorbés Le rendement quantique est unique pour chaque fluorochrome et dépendant des conditions, maximum : 1

Durée de vie à l’état excité On mesure le retour a l’état fondamental après une brève excitation t(ns)

Molécule non isolée

Extinction (« quenching ») de fluorescence dynamique Complexe à l’état excité kF F= ki + [Q] k Q + Q S1 kQ kF hF kci Chaleur hA F 2 1 Absorption Fluorescence

Extinction de fluorescence dynamique Dépend de l’accessibilité du marqueur fluorescent au quencheur. Complexe à l’état excité Dépend de la viscosité du milieu (h), de la température (T)…. F  Fo  [Q] [Q] La fluorescence diminue avec la concentration en Q  est fonction de [Q]

« Quenching » dynamique Établissement de la relation de Stern-Volmer : F Q (Fo/F)-1 Q

Extinction de fluorescence statique Complexe à l’état fondamental F  Fo  [Q] [Q] La fluorescence diminue avec la concentration en Q  n’est pas fonction de [Q] Ne dépend pas de la viscosité du milieu (h), ni de la température (T)….

Förster Resonance Energy Transfer Interaction dipolaire, transfert d ’énergie non radiatif Efficacité de transfert 50 % R0 R Distance de Förster R