Séquençage haut debit de grands panels en diagnostic : retours d’expériences dans le cadre de la déficience intellectuelle. A Piton, F Mattiolli, E Nourrisson, C Feger, J Lauer-Zillhardt, Y Herenger, M Miguet, L Mary, F Tran Mau Them, J Chelly, J Muller, C Redin, JL Mandel et B Gérard

Un travail d’équipe abTarabeuxeux abTarabeuxeux abTarabeuxeux Laboratoire de diagnostic génétique (NHC) Jean Louis Mandel Jamel Chelly Amélie Piton Julien Tarabeux Elsa nourisson Claire Feger Frédéric Tran Mau Them … Equipe « Mécanismes génétiques des maladies neurodéveloppementales » Jean-Louis Mandel Amélie Piton Francesca Mattioli Claire Redin Jean Muller Angélique Quartier Nicolas Haumesser abTarabeuxeux abTarabeuxeux abTarabeuxeux Julien Tababeux Claire Feger Elsa Nourisson abTarabeuxeux Frédéric Tran Mau Them Plateforme Bioinformatique des HUS Jean Muller, Lab Diagnostic, IGMA Anthony Le Bechec IRC

Plusieurs centaines de gènes impliqués dans la DI Causes environnementales Causes génétiques (anomalies chromosomiques et mutations dans plusieurs centaines de gènes) Déficience intellectuelle (DI) ~ 100 gènes de l’X > 100-200 Gènes de DI AR > 50 Genes de DI AD (de novo mutation) SYNGAP1 (Hamdan FF et al. 2009) STXBP1 (Hamdan FF et al.2011) FOXP1 (Hamdan Ffet al. 2010) etc

413 analysés (314 rendus) et 4 DPN Recrutement 2012- 2015 1141 demandes 413 analysés (314 rendus) et 4 DPN 496 en cours (analytique) 232 en attente Taux positif (+Classe 3) Classe 4-5 3 négatifs Total 1141 25 % (27,2 %) 78 7 229 314 Fille 308 27 % (36 %) 21 48 76 Garçon 833 23 % 57 181 238 Fréquence minimale car cohorte d’enfants négatifs

Grande hétérogénéité génétique 46 gènes mutés sur les 275 gènes testés, peu de récurrence (TCF4, DYRK1A, MECP2, GRIN1, FOXP1,MED13L, SYNGAP1, NAA10, ATRX)

Gènes localisés sur le chromosome X Parmi les 46 gènes, 16 sont sur le X et expliquent 35 % des cas

Lié à l’X 35 % 42 % 4 % Autosomique dominant Autosomique récessif Approche par DPNI ? Taux de néomutation : 78 %

Chaine de production des données Particularités du diagnostic : bon résultat au bon patient dans les délais annoncés Entrée clinique Pré analytique Analytique Bioinfo Inter prétation CR Anomalies de couverture des cibles : dossier de validation de méthode Préanalytique : 2 prélèvements CI + 2 parents Risque majeur : incompétence des biologistes : incapacité à reconnaître une mutation (faux négatif) ou surinterprétation (faux positif) Nécessite de mise en place de réunions pluridisciplinaire sur le sujets Réentrée pour réanalyse des données Expérience antérieure : réseau acroPuce Variant Classe 3, 4 Exploration familiale complémentaire Analyse ARNm délai

Améliorations du processus Accélération du processus d’analyse : pools parentaux Identification rapide des mutations de novo et vérification immédiate de la concordance du trio Ségrégation des mutations (RA, liées à l’X) Augmentation de la fiabilité des données : sondes controles Vérification de l’identitovigilance Vérification de l’absence de contamination sur les rs homozygotes Augmentation de la fiabilité de l’interprétation : RCP, réseaux d’expertise

Modalités de préparation du pool Série de 14 patients + Pool mères et pool pères 14 parents (1 pool mères et 1 pool pères) Représentation allélique attendue de 3,5 % (1/28) Phase de normalisation des ADN ++++ Préparation d’un pool équimolaire des échantillons

Analyse en parallèle du propositus et des pools de parents Pool mères Propositus Pool pères

Deux questions Si je vois 1 read dans le pool des parents, est- ce suffisant pour dire qu’il s’agit d’une mutation transmise ? Si je ne vois aucun read dans le pool, est ce suffisant pour dire qu’il s’agit d’une mutation de novo chez le propositus ?

Avantage des pool : Accélération du processus d’analyse (1) Variant rare classe 3 Hétérozygote (non connu) 0T/295 Variant faux sens Arid1B, potentiellement délétère, mais transmise par la mère : rejeté

Représentation du variant dans le pool de parent comparaison au bruit de fond de la technique Mesure du bruit de fond de la technique : analyse sur 2 exons standards Sureselect/Hiseq2000 : 0,8/1000 bases Seuil significatif > 5X bruit de fond (0,4 %) Prise en compte de la variation recherchée (0,1 %) Lecture 1 read à 100 x : variant transmis Lecture 1 read à 250 x significatif Lecture 1 read à 1000 x douteux Lecture 2 reads ou plus transmis

Deux questions Si je vois 1 read dans le pool des parents, est ce suffisant pour dire qu’il s’agit d’une mutation transmise ? Si je ne vois aucun read dans le pool, est ce suffisant pour dire qu’il s’agit d’une mutation de novo chez le propositus ?

Mutation de novo ? Pool mères Pas de délétion/213 Del hetero CHD2 Chez le propositus Pool pères Pas de délétion/258

Pool mères Pas de délétion/125 Del hetero SHANK3 Pool pères Pas de délétion/189

Vérification de la concordance du trio Père-Mère –Enfant Vérification de la représentativité des parents dans le pool Analyse de 3-4 variants rares (absence ExAc et non présent dans la base de données interne) Attention, ne permet pas d’identifier les inversions d’échantillons intraséries

L’analyse des pools permet de caractériser une mutation de novo Si couverture dans le pool > 300 X Si l’identité du trio et la représentation allélique des parents vérifiée pour au moins 4-5 autres variants rares Si la clinique compatible Risque : non détection d’une mutation à l’état mosaïque chez le parent L’analyse des pools permet de rendre une mutation rare transmise Vérification immédiate de la transmission en cis ou trans pour les allèles AR, pour les RMLX

Améliorations du processus Accélération du processus d’analyse : pools parentaux Identification rapide des mutations de novo et vérification immédiate de la concordance du trio Ségrégation des mutations (RA, liées à l’X) Augmentation de la fiabilité des données : sondes controles Vérification de l’identitovigilance Vérification de l’absence de contamination sur les rs homozygotes Augmentation de la fiabilité de l’interprétation : RCP, réseaux d’expertise

Analyse de SNP controles (1) : contrôle d’indentitovigilance Choix de 6 SNP : discrimination d’environ 1/500 MAF maximale (proche de 0,5) quelle que soit l’origine géographique Zone bien couverte (exon) Eloigné de SNP fréquents Chromosomes différents Rajout de sondes contrôles dans chaque design NGS 6 SNP + gene SRY Analyse par sonde Taqman

Analyse de SNP contrôles (2) : contrôle d’absence de contamination des échantillons Rs2292597 : patient attendu C homozygote ; lecture d’un A Analyse sur les différents rs homozygote

Améliorations du processus Accélération du processus d’analyse : pools parentaux Identification rapide des mutations de novo et vérification immédiate de la concordance du trio Ségrégation des mutations (RA, liées à l’X) Augmentation de la fiabilité des données : sondes controles Vérification de l’identitovigilance Vérification de l’absence de contamination sur les rs homozygotes Augmentation de la fiabilité de l’interprétation : RCP, réseaux d’expertise

Mutation frameshift dans un gène connu : le cas SLC2A1 (GLUT1) Déficit en GLUT1 : Encéphalopathie épileptique AD, avec ID, microcéphalie, hypotonie Taux abaissé de glucose et lactate dans le LCR Clinique : DI sévère, hypotonie Atteinte syndromique PC à -2 DS Glycorachie normale +/+ +/c.1412delG +/c.1412delG +/c.1412delG c.1412delG Identifié une seconde fois Mutation AR ? p.Gly471Glufs*37

Mutation stop de novo dans un gène connu : le cas SETBP1 Syndrome de Schinzel-Giedon: Dysmorphie faciale caractéristique Hydronéphrose Retard développement sévères Atteintes squelettiques Anomalies génitales Anomalies cardiaques Hyperactivité, TSA Clinique : DI avec hyperactivité PC +3 DS +/+ +/+ Classe 4 +/p.Gln186* +/+ DNMT3b et mutations somatiques en cas de syndrome myelodyslasique Base ExAC : 7 mutations nulles

Mutations faux sens dans un gène connu : le cas CASK +/p.Gly206Ser +/+ + +/p.Gly164Arg p.Gly206Ser p.Gly164Arg Clinique : DI sevère Troubles psychiatriques, Troubles du comportement Strabisme Clinique : Crises tonicocloniques Troubles du comportement enophtalmie Complexe synaptique Domaine proteine kinase

Mutations de novo dans un gène « connu » : le cas POGZ Clinique : DI sévère Microcéphalie Retard staturo pondérale Autisme Auto et hétéro agressivité Hypotonie Ataxie Clinique : DI sévère Autisme Auto et hétéro agressivité Ataxie discrète c.2400dup/+ c.2574del/+ Mutations nulles identifiées chez des patients avec autisme

Mutations de novo dans un gène connu : le cas AUTS2 Clinique : RCIU Retard development PM Retard de language TSA Clinique : DI moyenne Retard development PM Retard de language TSA PC à -2,5 DS c.1482dup (p.Arg495Alafs*15) c.1245_1246del (p.Gln416Alafs*93) facteur de risque ? Cf poster N°3394

Les découvertes incidentes : le cas KIAA2022 Clinique : DI sévère Retard de langage Epilepsie (myoclonie, crises atoniques) Clinique habituelle chez les garçons: TSA Epilepsie (spasme de flexion) Retard de langage c.3597dup/+ Clinique habituelle chez les filles : Généralement asymptomatique Rares cas d’épilepsie 1 cas rapporté avec microcephalie et Retard de croissance, TSA Conseil génétique : Risque pour la descendance de M. Risque de récurrence pour les parents de M.

Nécessité de mettre en place des réunions clinico-biologiques sur le modèle des RCP : un travail de réseau

Exploration familiale complémentaire Points de blocage Entrée clinique Pré analytique Analy tique Bioinformatique Interpré tation CR Variant Classe 3, 4 Exploration familiale complémentaire Analyse ARNm

Implication des laboratoires français dans le diagnostic de la DI Nécessité de s’appuyer sur les expertises cliniques et biologiques existantes (réseau, visioconf, filieres) Panel DI proposés dans 18 laboratoires (DI44, 10 ; DI200+, 5 et Exome, 3) Réunion par visioconférence tous les 2 mois : discussion de cas cas ciniques,, Méthodologie, stratégies, …

Poster 3141 Redéfinition de la population cible Rentabilité diagnostic : taux de + (faible % mais sur le territoire entier ou fort % sur un petit territoire). Inégamlité des soins Finalité : diagnostic, conseil génétique, essais cliniques, lien entre les familles pour écrire l’histoire naturelle (GenIDA) Poster 3141