La cytométrie en flux en immunologie Hôpital L’Archet - Nice - La cytométrie en flux en immunologie par Frédéric Larbret

Introduction à la cytométrie en flux Origine de la cytométrie en flux : 1934: applicable aux cellules hématopoïétiques(comptage) 1941: développement des techniques d’anticorps couplés 1960: développement des premiers cytomètres Définition : La cytométrie en flux permet l’étude précise de cellules isolées entraînées dans un flux liquide. Les cellules, alignées les unes derrière les autres, sont analysées une par une en défilant à grande vitesse (plus de 30Km/h) devant une source lumineuse (un laser). Intérêt : C’est une technique rapide qui permet une caractérisation : individuelle de chaque cellule quantitative (intérêt statistique) qualitative et multiparamétriques (morphologie de la cellule et phénotypage)

Principe Propulsion des cellules une à une à grande vitesse dans un flux hydrodynamique Passage devant une source lumineuse (Laser) Récupération de la fluorescence issu d’un immunomarquage le plus souvent Adaptée aux cellules en suspensions et donc à L’analyse de liquides biologiques : Sang Lavage broncho-alvéolaire ascite ou épanchement pleural Liquide céphalorachidien aspiration médullaire Possibilité tout de même d’analyser des cellules tissulaires après dissociation

Intérêt Monitoring de l’état immunitaire des patients dans différentes maladies: déficits immunitaires infections graves maladies inflammatoires chroniques auto-immunité au décours de traitement (immunostimulants, immunosupresseurs, vaccinations…) Evaluation du pourcentage des différents types cellulaires que compte le système immunitaire

La différenciation lymphoïde et myéloïde CD3+ CD3+/CD4+ CD56+ CD3+/CD8+ CD19+ CD14+

les immunomarquages + Immunomarquage direct Immunomarquage indirect Ac-FLUO1 Immunomarquage indirect Ac-secondaire fluorescent Ac-primaire Non fluorescent +

les fluorochromes

Présentation des données

La cytométrie polychromatique 1 Colour 2 Populations 1 2 2 Colour 4 3 Colours 1 2 3 12 4 Colours 24 5 Colours 40 6 Colours 60

La cytométrie polychromatique

Fluorochromes et compensations Importance dans le choix des combinaisons de fluorochromes FL2 - %FL1 AVANT APRES

Composition d’un cytomètre

Composition d’un cytomètre 1 3 2 Un cytomètre est une combinaison de 3 différents systèmes : Système fluidique : Flux laminaire qui permet aux cellules en suspension de passer une à une devant le laser 1 3 2) Système optique : Rayon laser et différents filtres qui permettent de sélectionner les longueurs d’ondes appropriées 3) Système électronique : - PMT qui capte la lumière émise, - Digitaliseur qui la transforme en signal électrique puis en signal numérique, - Ordinateur qui gère et entrepose les données 2

La fluidique Système basé sur le principe de Focalisation hydrodynamique

Le tri cellulaire

Le tri cellulaire Clonage cellulaire

séparation des excitations L’optique séparation des excitations Le trajet optique Les filtres

Les paramètres FSC/SSC Mesures de phénomènes de diffusion lumineuse : - Forward Scatter (FSC) : la lumière diffractée est collectée sous un petit angle (1 à 10°). Le signal est relatif à la taille de la cellule. ( = Taille de la cellule)‏ - Side Scatter (SSC) : la lumière est collectée à 90° de l’axe du laser. Le signal est relatif à la granularité de la cellule. ( = granulométrie de la cellule)‏

(Photomultiplicateur)‏ L’électronique PMT (Photomultiplicateur)‏

Principe de fonctionnement d'un convertisseur

Mesure de la frequence de distribution des cellules

Les applications Application la plus courante : Le comptage de lymphocytes T pour le suivi des infections HIV ou de greffes. Principe 50 à 100uL de sang Ajout des Ac couplés Possibilité d’ajouter : CD16 (neutrophile ) CD14 ou CD15 (monocytes) Avantages Intérêt statistique rapide (3min d’analyse) multiparamétrique donc précise (cas des monocytes CD4+ mais CD3-)

Rapport CD4/CD8 doit être Les applications Résultats attendus d’un sujet sein (sur sang périphérique) : LyT CD3+/CD4+ = 66% LyT CD3+/CD8+ = 33% Rapport CD4/CD8 doit être 2/3 à 1/3

Les applications Observations de sous-types rares et encore très méconnus : LyT CD8+/CD56+ (très cytotoxiques ??) LyT CD4+/CD8 dim <2% LyT CD8+/CD4dim <3% Recherche Intérêt du trieur de cellules

Les applications Utilisation d’ac spécifiques des chaines αβ ou γδ Domaine d’intérêt LTγδ impliqués dans des pathologies des muqueuses: Asthme Maladies inflammatoires de l’intestin activité de protection contre le cancer infections à CMV (LT γδ++ pdt plusieurs années) cicatrisation LTαβ majoritaire +90% des LT dans le sang reconnaissent des peptides LTγδ minoritaire 2 à 10% les LT dans le sang sont CD4-/CD8+-/CD56+- reconnaissent des glycolipides bactériens, fongiques ou tumoraux

Les applications Analyse par CMF de la diversité des clones lymphocytaires par analyse des clonotypes V des chaînes du TCR: - Actuellement 20 à 30 Ac disponibles pour l’identification de la partie variable de la chaine β Permet d’identifier d’éventuelles proliférations monoclonales avec un phénotype particulier Cas des LT CD4 dans la maladie de Sézary

Les applications Diagnostiques et pronostiques des hémopathies malignes : - La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l’hémopathie maligne la plus fréquente du sujet âgé. - Diagnostic par hémogramme et phénotypage - Orientation des décisions thérapeutiques en fonction des marqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie

! Les applications Rô Les tests fonctionnels Test d’activation in vitro : CD25 ou CD69 type de population répondant CD4 + souvent - Types Lt (naïfs, effecteurs, mémoires) + Stimulants Cytométrie en flux Antigènes infectieux Antigènes vaccinaux Lt CD3+ ! Les Lt circulants n’expriment majoritairement pas de marqueurs d’activation Excepté 2% des CD4+ : les T régulateurs (CD4+/CD25+/CD127-/FoxP3 +) Rôle important dans la production de cytokines immunosupressives (IL10 et TGFβ) et donc dans la tolérance immunitaire (grossesse, tumeur et greffes) Rô

Les applications

Les applications Tests de prolifération : test au CFSE 0 division 1ere division 2ieme division 3ième division * Un lymphocyte T se divise 6 à 8 fois en moins de 10 jours Utilisé dans les tests de transformation lymphoblastiques

Les applications Normal Aneuploïdie (tumeur) Sert pour le suivi des patients atteints de cancer du sein * Outil de diagnostique et de pronostique

Les applications

Les applications

Analyse de la mort cellulaire Nombreuses techniques qui correspondent chacune à différentes étapes de la mort cellulaire Dioc6 Fas/ Fas L Activation des récepteurs Cytochromes C / APAF-1 Réduction du potentiel mitochondrial Annexine V /7AAD Activation des caspases Exposition de la phosphatidyl-sérine Pic Sub-G1 Changements morphologiques Fragmentation de l’ADN t

Les protéines fluorescentes

Les protéines fluorescentes