cellules progénitrices (d'amplification transitoire) souche cellules progénitrices (d'amplification transitoire) 1. auto-renouvellement 2. prolifération 3. différenciation cellules différenciées 2. Régénération d'un tissu blessé Tissus à renouvellement rapide: épiderme (2-3 semaines) intestin (108 cellules/jour) cellules sanguines (1012 globules/jour) Tissus ne se renouvelant pas ou peu: muscle (satellites) cerveau (hippocampe, plancher du IVe ventricule) foie (cellules ovales) cœur (?)

La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique Cellules souches Précurseurs matures Progéniteurs intermédiaires Remplacement permanent de l’ensemble du tissu- Efficacité retardée - Cellules souches hématopoïétiques Cellules souches épidermiques MAPC? CS mésenchymateuses? Remplacement transitoire des tissus Efficacité rapide - Progéniteurs endothéliaux , myoblastes - Progéniteurs ilôts b de Langherans Précurseurs ostéoblastiques / chondroblastiques Neurones foetaux - Transfusion de globules rouges Remplacement très transitoire Efficacité immédiate

A quoi sert une cellule souche ? épiderme Cellule souche derme Mesenchymal connective tissue Peau, intestin (108 cell/j), système hématopoïétique 1012 globules/jour

Reconstitution du système immunitaire A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ? NK B Mo PN Dend GR Meg CS hématopoïétique Lignées hématopoïétiques T Thérapies liées au système hématopoïétique (ex. leucémie) 1000 rads Greffe de moëlle ou autre tissu Reconstitution du système immunitaire 6 mois Till & Mc Culloch, 1961

A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ? Thérapie des grands brûlés

(> 200 types cellulaires) (ne se reproduisent pas) embryon pré-implantatoire Pluripotentes cellules souches embryonnaires (ES) trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) œuf fécondé (jour 1) stade 8 cellules (3 jours) Totipotentes (> 200 types cellulaires) (ne se reproduisent pas) cellules souches germinales embryonnaires (EG) Pluripotentes Embryon de 6 semaines cellules foetales ou multipotentes cellules souches de sang de cordon Pluripotentes ou multipotentes Nouveau-né Cellules de carcinome embryonnaire (EC) Pluripotentes Tératocarcinome (cellules tumorales testiculaires) cellules souches adultes Multipotentes et unipotence adulte

Pourquoi s’interesse-t-on aux cellules souches. 1 Pourquoi s’interesse-t-on aux cellules souches ? 1. Etude des mécanismes de différenciation 2. Evaluation d’un potentiel thérapeutique 3. Comprendre des pathologies liées à l’auto-renouvellement et à la différenciation (cancer).

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE Le transporteur “ATP-binding cassette transporter” expulse le colorant vital. Excitation à 350 nm (UV) Emission fluorescence à 2  différents. Hoechst red (675 nm) Verapamil (inh. du transporteur ABC) Hoechst blue (440 nm)

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES: EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE cellules différenciées assise basale (couche proliférative) Injection de 5-bromo-deoxyuridine (BrdU), BrdU remplace la dT 4 semaines de chasse sans BrdU Impossible chez l'homme (greffe)

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE Ensemencement en condition diluée paraclone méroclone holoclone

Localisations principales des kératinocytes clonogeniques (BrdU, 3H-Thy) clonogénicité glande sébacée faible activité mitotique in vivo forte activité clonogénique in vitro bulge forte activité mitotique in vivo faible activité clonogénique in vitro bulbe

Comment identifier les cellules souches adultes ? EVIDENCES INDIRECTES : EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE 1000 rads Greffe de moëlle Reconstitution d’un système hématopoïétique Contribution tissulaire 6 mois Till & Mc Culloch, 1961 Traitement des leucémies (pathologies du système hématopoïétique)

Multipotence des cellules souches épidermiques 10 semaines épiderme glande sébacée follicule pileux multipotence Transplantation in utero d'un bulge ß-gal Transfert du greffon sur souris nude

Plusieurs classes de cellules souches épidermiques Ghazizadeh and Taichman (2001) Embo J 20,1215-1222 En condition de réparation ou également en situation physiologique ?

Comment identifier les cellules souches adultes ? EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE EVIDENCES INDIRECTES : CD= cluster designation CSH CD7+ Lymphocyte T Natural Killer CD19+ Lymphocyte B Monocytes CD13+ Polyneutrophiles Cellules dendritiques Hématies CD41+ Mégacaryocyte (plaquettes) CD34+ DR- CD38- CD33- CD34+ DR+ CD38 + CD3 + CD34-

Le concept de "niche" Notch Wnt (ß-caténine/LEF1) c-Myc BMPs épiderme follicule pileux glande sébacée progéniteur multipotent cellules différencées Cellule souche Influence réciproque

cellules différencées épiderme follicule pileux glande sébacée progéniteur unipotent cellules différencées Cellule souche

(UV, stress oxydants, hypoxie,…) La cellule souche: cible privilégiée de la cancérogenèse? apoptose Arrêt du cycle réparation S G2 M G1 checkpoint p53 Stress génotoxiques (UV, stress oxydants, hypoxie,…) Dommages à l'ADN Accumulation de mutations Instabilité télomérique (ALT) Tumeur

Mutation p53 (UV) TA Cellule différenciée CS

Expansion clonale:augmente le nb de cellules qui peuvent ainsi accumuler de nouvelles mutations Accumulation de mutations Mutation p53 initiateur DMBA (Ha-ras) Expansion clonale UV-B soutenue Promoteur TPA

Squamous cell carcinoma cancers cutanés Papilloma & Squamous cell carcinoma (Ras, p53, PTEN) épiderme Sebaceous Adenoma (LEF-1, MSH2) Basal cell Carcinoma (SHH, p53) derme Trichofolliculoma (ß-caténine, PTEN) & Pilomatricoma

Plasticité des cellules souches Invertébrés: hydre Regénère même sa tête!! Persistence d’une niche de cellules totipotentes, recrutées en cas de lésion. Cnidaires: méduses, les coraux, les anémones de mer et autres polypes. Coupé, formera autant de vers complets!! plathelminthe: vers plats

Plasticité des cellules souches Vertébrés: Cicatrisation (Days 1-2) Dé-differenciation (Days 3-12) Formation du blastème (Days 13-21) Re-différentiation (Days 22-40) salamandre (régénère tous ses membres (œil, queue, portions de cœur) amphibiens nocturnes, de l’ordre des urocèles Les cellules à proximité de la lésion (surtout fibres musculaires) se dédifférencient pour former un blastème régénératif contenant des progéniteurs mésenchymateux.

Plasticité des cellules souches Differentiation Morphallaxis (allaxis= exchange) Hydre La régénération d’une partie du corps se fait par une réorganisation cellulaire et structurale avec un nombre restreint de nouvelles cellules (pas de prolifération) Cellules souches totipotentes Differentiation Proliferation Epimorphosis Salamandre Cellules souches ou progénitrices Dedifferentiation recrutement de néoblastes hors de l’organe blessé (forte prolifération)

L’Homme est-il: Une Hydre ? + ou Une Salamandre ?

A quoi est due cette incapacité régénératrice chez l’Homme? Absence de persistence de cellules totipotentes? (Hydre) Limitation du niveau de dédifférenciation? (Salamandre)

“Transdifférenciation (plasticité)” astrocytes neurones oligodendrocytes Précurseurs neuronaux CERVEAU Révolution de dogmes: - passage au travers des feuillets embryonnaires ? -potentiel en médecine régénératrice ? PANCREAS (Seaberg 2004 Nat Biotech Choi 2004 Stem cells) pancreatic endocrine ß-, - and -cells, pancreatic exocrine, stellate cells FOIE hépatocytes Muscle squelettique MOELLE OSSEUSE CSH Brain to blood ! Cellules endothéliales Chondrocytes ostéocytes CŒUR cardiomyocytes PEAU Kératinocytes Fibroblastes Adipocytes (liposuccion)

Protocole date de 1961 mais la plupart de ces observations faites entre 1999 et 2004!!!!! 1000 rads Greffe de moëlle ou autre tissu Observation dans les différents tissus chez la souris et post mortem chez l’homme (receveur de greffe de MO) 6 mois Till & Mc Culloch, 1961

Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC)

Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC) (Jiang et al. Nature 2002 418, 41-9) Conversion à l’échelon clonal des MAPC en: cellules endothéliales, ectodermiques et endodermiques, in vitro et in vivo

Thérapie cellulaire: Réparer une fonction déficiente Reconstitution du tissu d'origine Reconstitution d'un tissu autre que celui d'origine (plasticité) Skeletal muscle

L’Homme n’est donc ni une hydre, ni une salamandre… Contaminant de cellules circulantes Population hétérogène (non clonale) Fusion cellulaire

Isolement de cellules neurales cell fusion causes confusion! Cerveau Cellules ES Promoter oct4- gfp/puromycin Isolement de cellules neurales puroR et gfp+