Spectroscopie IR comme dichroïsme circulaire : => estimation des structures secondaires présentes dans les protéines Spectroscopie Raman : => Modes vibrationnels des protéines également => Complémentaire de l'infrarouge => Bandes correspondant uniquement au molécules polarisables

I.1 – 2. Spectroscopie Raman Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman

Effet Raman, indépendant de la longueur d'onde Interaction de photons avec la molécule, diffusion de la lumière

Absorption du rayonnement par les molécules polaires Effet Raman : Diffusion liée à la polarisabilité de la molécule Infrarouge : Absorption du rayonnement par les molécules polaires

Modes normaux de vibrations actifs en spectroscopie Raman : => polarisabilité de la molécule Exemple : CO2 Élongation symétrique active Changement de la polarisabilité Élongation antisymétrique non active Cisaillement non active

I.2. Méthodes prédictives Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes (HCA)

Méthode HCA : Hydrophobic Cluster Analysis = Analyse des clusters hydrophobes Brin  : vert Hélice 1 : orange Hélice 2 : rouge Antitrypsine

1D 3D

Représentation bidimensionnelle La séquence est enroulée en hélice α autour d'un cylindre

Représentation bidimensionnelle Coupe transversale du cylindre => diagramme bidirectionnel

Représentation bidimensionnelle => diagramme bidirectionnel doublé

Représentation bidimensionnelle => les clusters hydrophobes sont tracés en fonction de l'hydrophobie des aa Brin  : vert => cluster vertical Hélice 1 : orange et Hélice 2 : rouge => cluster horizontal

Graphes HCA Insuline Chaîne A Insuline Chaîne B

Méthode HCA : méthode visuelle => pas d'automatisation Très bons résultats pour feuillets β et hélices α amphiphiles

I.2 – 2. Méthodes « automatiques » Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes I.2 – 2. Méthodes « automatiques »

Définit la propensité d'un acide aminé à se conformer Basée sur des statistiques de conformations + hydropathie => méthodes empiriques ou Basée sur l'observation de similarité de séquence => comparaison des séquences avec des références

10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | sequence ATFNKKNNCPFTVWAGAVPGGGKQLGTGQTWTINVAAGTKGARIWPRTNCNFDGAGRGRCQTGDCGGLLQ DPM cchttttctceeeeecccttccccctctceeeeeehhttcchheeccctctcctttttcttctttcccec DSC ceeeeeccccceeeeeccccccccccccceeeeeeccccccceeeeeeeeeeccccceeeeeccccceee GOR4 cccccccccceeeeeeccccccccccccceeeeeeeccccceeeeceecccccccccceeccccccccee HNNC cccccccccceeeeecccccccccccccceeeeeeecccccceeecccccccccccccccccccccccee PHD ceeeeecccceeeecccccccceeeccccceeeecccccccceeeeccccceccccccceecccccceee Predator ccccccccccceeeeeccccccccccccccceeeeeccccceeeeecccccccccccccccccccccccc SIMPA96 cccccccccceeeeecccccccccccccceeeeeeccccccceeecccccccccccccccccccccceee SOPM eeeccttccceeeeetcccttcccccttceeeeeeettcccceeccccccccctttccccccccttceee Sec.Cons. cccccccccceeeeecccccccccccccceeeeeeecccccceeecccccccccccccccccccccc?ee 80 90 100 110 120 130 140 séquence CQGYGQPPNTLAEYALNQYMNRDFYDISLIDGFNVPMDFSPVSNGCTRGIRCTADINGQCPAQLRAPGGC DPM ettccccccchhhhhhccccccceeceeeeccececcccccettctccceeeehccctctchhhhttttt DSC eecccccccceeeeeeccccccceeeeeeeccccceeeecccccccceeeeeeeeccccccccccccccc GOR4 ccccccccchhhhhhhhhhccccceeeeeeccccccccccccccccccceeeecccccccceeeeccccc HNNC cccccccchhhhhhhhhhhhhhccceeeehcccccccccccccccccccceecccccccccccccccccc PHD eccccccchhhhhhhhhcccccceeeeeeecccceeeccccccccccccccecccccccccccccccccc Predator cccccccccceeeeccccccccccccccccccccccccccccccccceeeeeeccccccccccccccccc SIMPA96 ccccccccchhhhhhhhhcccccccceeecccccccccccccccccccceeeeccccccccccccccccc SOPM cccccccccchhhhhhhhhhhtthheeeeettcccceeeccccttccceeeeeeccttccccccccttcc Sec.Cons. ccccccccc?hhhhhhh?cccccceeeeeeccccccccccccccccccceeeeccccccccccccccccc 150 160 170 180 190 200 | | | | | | séquence NNACTVSKTDQYCCNSGHCGPTDYSRFFKSRCPDAYSYPKDDATSTVLFTCPGGTNYRVVFCP DPM ctceeeecccccctttttctccccceeehtcccccccccccccceeeeeeccctcceeeeecc DSC cccccccccceeeeccccccccchhhhhhccccccccccccccceeeeeccccccceeeeecc GOR4 cccceeccccceecccccccccccceeeeeccccccccccccceeeeeeecccccceeeeeec HNNC cccceeccccccccccccccccchhhhccccccccccccccccceeeeeecccccceeeeecc PHD cccceeccccceecccccccccchhhhhhhccccccccccccccceeeeccccccceeeeeec Predator ccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccceeeeeccccccceeeccc SIMPA96 cccccccccceeeecccccccchhhhhhhcccccccccccccccceeeeecccccceeeeeec SOPM ccceeeeccceeectttcccccchhheehccccccccccccccceeeeeecccccceeeeeec Sec.Cons. cccceeccccceecccccccccchhhh?hccccccccccccccceeeeeecccccceeeee?c

Prédiction de la structure secondaire Dépend de la structure primaire : Environnement local de chaque acide aminé Propriétés physico-chimiques des acides aminés relation entre hydrophobie et conformation hélices ou feuillets amphipatiques Validité : prédictions fiables à 70% - 75%

II. Détermination de la structure tridimensionnelle Chapitre 1 – Structure des protéines Chapitre 2 – Le repliement des protéines Chapitre 3 – Détermination de la structure des macromolécules biologiques I. Détermination de la structure secondaire I.1. Méthodes expérimentales I.1 – 1. Spectroscopie Infrarouge I.1 – 2. Spectroscopie Raman I.2. Méthodes prédictives I.2 – 1. Analyse des clusters hydrophobes I.2 – 2. Méthodes « automatiques » II. Détermination de la structure tridimensionnelle

Étude structurale d’une protéine Structure primaire Structure tertiaire

Protéine purifiée Protéine cristallisée : Xtallo (cristallographie et diffraction des rayons X) Protéine en solution : RMN (Résonance magnétique nucléaire) Protéine non purifiée mais dont le cDNA est connu Déduction de la séquence primaire Prédiction de la structure secondaire Prédiction de la structure tertiaire par modélisation moléculaire (par homologie ou analogie)

Analyse de la structure tertiaire et quaternaire méthodes expérimentales : Obtention de coordonnées atomiques Cristallographie et diffraction des rayons X Spectroscopie de résonance magnétique

Cristallographie et diffraction des rayons X Pourquoi des rayons X ? Longueur d’onde de la lumière visible trop longue pour visualiser des atomes Longueur d’onde des rayons X voisine de 1Å (0,2 à 2Å) proche de la distance entre atomes Il existe une relation directe entre la structure d'un cristal et la carte de diffraction des rayons X qui le traversent => Loi de Bragg

Source des rayons X Des électrons bombardent une anode métallique Le synchrotron (ici celui de Grenoble) : les électrons de haute énergie circulent dans des anneaux de stockage

Les cristaux Cristallisation => solutions super-saturées en proteines (0,5 à 200 mg/mL) + agents qui réduisent la solubilité -> point de précipitation => favoriser l'apparition d'un site de nucléation Ensuite expansion du cristal -> taille limite 2 techniques : diffusion de vapeur et dialyse à l'équilibre + conditions expérimentales empiriques (robotisation)

Cristal : empilement infini et régulier de motifs identiques, un motif pouvant être un atome ou bien une molécule. infini : la distance entre deux molécules voisines d'un cristal est de quelques angströms (1 Å = 10-10 m), donc dans un cristal de 1 micron cube, il y a de l'ordre de 1012 atomes, soit 10 000 milliards régulier : les atomes sont empilés de manière ordonnée, selon un schéma répétitif ou "réseau" (lattice en anglais) Le réseau cristallin est un ensemble de points, ou "noeuds", en 3 dimensions L'unité élémentaire répétée est la maille

Réseaux cristallins La maille suffit à reconstruire tout le réseau. Si on la translate selon n'importe quelle direction dans le cristal, on reproduit le même arrangement spatial. Réseau hexagonal plan : translations possibles Périodicité spatiale : translation dans l'espace selon certains vecteurs chaque atome est exactement dans le même environnement Deux déplacements élémentaires = périodes conservant ce réseau Le réseau obéit aux règles de la symétrie => description mathématique

En trois dimensions : 7 types de mailles élémentaires cubique maille = cube hexagonal maille = prisme droit à base hexagonale quadratique maille = prisme droit à base carrée orthorhombique maille = parallélépipède rectangle parallélépipèdes rectangles rhomboédrique maille = parallélépipède d'angles quelconques arêtes => longueurs identiques triclinique maille = parallélépipède quelconque monoclinique maille = prisme oblique à base rectangulaire prismes droits prismes obliques

il n'existe que 230 groupes d'espace en cristallographie. Symétries cristallines et groupes d'espace = isométrie (transformation qui conserve les distances) => translations dans un plan, rotations autour d'un axe, symétrie horizontales ou verticales, rotations et inversions simultanées => Un atome a pour "image" un atome identique => globalement invariant Toutes les symétries possibles pour un réseau cristallin forment un groupe fini <=> groupe d’espace En raison des propriétés de l'espace géométrique il n'existe que 230 groupes d'espace en cristallographie. La diffraction des rayons X dépend des propriétés du réseau cristallin et est le résultat des interactions entre les rayons X incidents et les électrons des atomes dans le cristal

Loi de Bragg = diffraction des rayons X par les électrons

Diffraction des rayons X Faisceau diffracté par plusieurs molécules => somme des diagrammes de diffraction individuels : les molécules diffusent les RX dans les mêmes directions => augmentation du signal => diagramme de tâches exploitable Rotation du cristal dans le faisceau de rayons X => liste de réflections = positions + Intensités

Diffraction des rayons X Diagramme de diffraction = tâches de diffraction imprimées sur un film photo ou détecteur électronique Intensité de la tâche <=> amplitude de l’onde diffractée <=> nombre d’électrons de l’atome Position des tâches <=> identification des plans de symétrie à l'origine des diffractions

Carte de densité électronique

Carte de densité électronique

Carte de densité électronique Pour résoudre le problème de phase Méthode de remplacement moléculaire Utilisation d ’une structure homologue déjà résolue => basses résolutions Méthode de remplacement isomorphe multiple Ajout au cristal d’un ou plusieurs ions de métal lourd (mercure Hg , platine Pt) => basses résolutions Dispersion multiple Anomale Remplacement du souffre de la méthionine par du sélénium => requiert un synchrotron => hautes résolutions

Importance de la résolution

Le modèle moléculaire => la structure tertiaire

Le modèle moléculaire => la structure tertiaire Séquence primaire nécessaire Repérage des liaisons peptidiques des chaînes latérales particulière

Le modèle moléculaire => la structure tertiaire => logiciels de modélisation + oeil de l'expert !!! => Affinement de la structure

Le modèle moléculaire => la structure tertiaire (résumé) Atomes d'hydrogènes absents

Avantages et inconvénients Image 3D Pas de limite de taille Protéines fonctionnelles Méthode éprouvée (1960) Plus de 33000 structures résolues (PDB 2005) Inconvénients Système moléculaire " figé " (cristal) Zones trop variables invisibles Pureté et quantité des échantillons Travail à basses températures Cristallisation empirique Résolution du problème de phase Méthode relativement longue