Techniques immunologiques Université Badji Mokhtar (Annaba) Cours de techniques immunologiques Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Année 2008/2009
Cytométrie en flux
Exemple d’application de la cytométrie en flux: Etude de l’expression du récepteur de l’IL-27 sur les lymphocytes B
Obtention des Lymphocytes B humains A partir de fragments de rate Par Sélection positive (Microbeads, MACS) et tri magnétique préparatif (Miltenyi Biotech) A partir du sang de cordon Par Déplétion négative (Rosettesep, StemCell) Ajout du cocktail Rosettessep Ac anti-CD2, CD3, CD16, CD36, CD56 et CD66b couplés à des anticorps anti-glycophorine A Marquage magnétique (30 min) Séparation magnétique Cellules B spléniques CD19+ (naïves et mémoires) Cellules B ombilicales naïves CD19+CD27- Formation d’immunorosettes Elution des cellules marquées Collecte des cellules à l’interface Plasma/Ficoll
Mise en culture des cellules B naïves ou mémoires 5% CO2 à 37°C Anti-CD40 IL-27, IL-21, IL-4 Mise en culture dans du milieu YSSEL (10% SVF) Détermination de la réponse proliférative Production d’IgE et d’IgG Après 4 jours Après 12 jours Incorporation de la H3-thymidine Récupérer les surnageants de culture Mesure de la radioactivité incorporée par l’ADN cellulaire Dosage ELISA: IgE isotypes d’IgG
Analyse de l’expression de l’IL-27R et des différents autres marqueurs membranaires Marquage direct ou indirect par immunofluorescence simple, double ou triple En utilisant des Ac couplés aux fluorochromes (FITC, PE ou APC) Passage au cytomètre (FACSCan BD) et/ou Tri cellulaire (FACS Vantage BD) et enfin analyse par le logiciel Cell Quest
Expression des sous unités (TCCR et gp130) du récepteur de l’IL-27 sur les cellules B Cellules B naïves (CD19+CD27-) du sang de cordon Cellules B mémoires (CD27+) de la rate Cellules B naïves (CD27-) de la rate Selon la littérature (Larousserie et al., 2006) : les 2 sous unités de l’IL-27R sont constitutivement exprimées Sur les Lc B d’amygdales humains naïfs et mémoires