Présenté par : DIAGNE Ahmed DIVERSITY and ABUNDANCE of GRAM POSITIVE BACTERIA in a TIDAL FLAT ECOSYSTEM H STEVENS T BRINKHOFF B RINK J VOLLMERS 2007 Présenté par : DIAGNE Ahmed Master 1 Biologie et Ecologie marine

Objectif de l’étude Montrer l’abondance et la diversité des bactéries gram+ dans un écosystème sous influence de marée. Différence entre les bactéries gram+ à affinité marine et celles à affinité d’eau douce par analyse DGGE. Montrer que les bactéries gram+ sont indigènes et non introduites à ce milieu .

Techniques utilisées Isolement des bactéries par dilution avec différents substrats supplémentaires au milieu de culture. L’hybridation Fluorescente in situ(Fish)→ utilise des sondes fluorescentes qui reconnaissent des taxons précis (classe,genre ou espèce). Electrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE) afin de séparer les molécules d’acides nucléiques par leur migration sous l‘action du dénaturant.

Isolement des bactéries par dilution avec différents substrats supplémentaires dans le milieu de culture(eau de mer) En mai : 63 isolats dont 17 sont gram+ ►Actinobactéria (gram+) 27% ►Proteobactéria (alpha et gamma) 65% Ce résultat chiffré met en évidence l’abondance des bactéries gram+ dans cet environnement côtier.

Affiliation phylogénétique de l’Actinobacteria basée sur les séquences des gènes codant pour l’ARNr 16S

Affiliation phylogénétique de l’Actinobacteria basée sur les séquences des gènes codant pour l’ARNr 16S

Analyse de l’arbre phylogénétique Les séquences sont principalement groupées dans six familles de bactéries gram+. → Microbacteriaceae : groupe I ,II → Micrococcaceae : groupe III IV V VI → Nocardiaceae :groupe VII VIII → Pseudonocardiaceae : groupe IX → Nocardiodacae : groupe X → Baccili : groupe XI XII XIII XIV XV ►La diversité des bactéries gram+ est prouvée par les différents groupes de famille représentés dans l’arbre phylogénétique

L’analyse du DGGE des modèles de bandes d’actinobacteria-spécifique de la libre vie(LF) et des communautés associées au particules (PA) collectés aux stations 1-5 à proximité de la station B de la mer de Wadden Les échantillons marins sont semblables par la Bande DG3 et différents de ceux de l’eau douce par la bande DG1.

Croissance des bactéries gram+ dans divers gamme de salinité (1‰ – 45 ‰) → La majorité des groupes de bactéries gram+ semble bien croître différemment dans les gammes de salinité qui avoisinent ce milieu côtier.

►Différence entre les bactéries gram+ marines et celles d’eau douce. Mise en évidence du statut indigène des bactéries gram+ dans l’environnement marin La communauté bactérienne gram+ semble être indigène à cet environnement marin par : ►l’Adaptation des bactéries gram+ aux conditions de salinité ambiante de la mer de Wadden. ►Leur milieu de vie est caractérisé par une forte entrée de nutrients, dynamique de salinité, lumière, oxygène et température (habitat exceptionnel). ►Différence entre les bactéries gram+ marines et celles d’eau douce.

Remarques La diversité bactérienne gram+ que reflète l’arbre phylogénétique est peu fiable car non vérifiée par la méthode de Bootstrap. Cette diversité est plus importante que celle observée par les études antérieures d’autres auteurs(Suzuki et al,1997). Le statut d’indigène devrait tenir compte de l’apport des marées qui pourrait influencer le milieu. Faire une étude se rapportant à l’effet des marées sur la composition spécifique de ce milieu côtier.

Merci pour votre attention

Localisation de la mer de Wadden ↑

Les endroits(A et B) de collecte des échantillons Les endroits(A et B) de collecte des échantillons station1 conduite d’eau douce station2-5 sont marines

Procédures expérimentales de certaines techniques utilisées Lieu de collecte des échantillons : Réalisée le 27 mai et le 25 octobre 1999 dans la mer de wadden Est Frisian,Allemagne Endroits de collecte A ( 53°37’N ; 07°08’E ) B (53°42’N ; 07°43’ E ) ► Isolement des bactéries : l’inoculum est 1ml d’eau une série de 10 dilutions est effectuée rajout de substrat supplémentaire :Agar ,alginate, caséine , cellulose, chitine, laminarin , (Difco,Allemagne) croissance par turbidité vérifiée au microscope diverses bactéries ont été isolées la pureté des isolats est examinée par analyse du DGGE

Amplification des gènes ribosomiaux 16S par la méthode du PCR Utilisation des amorces : S-C-Act-235-a-S-20 et S-C-Act-878-a-A-19(stach et al,2003) La chromatographie a été rajoutée à l’analyse du DGGE (Muyzer et al, 1998) Dénaturation prolongée de 40 à 60 secondes entre 67°C et 72°C. Avec le PCR (Polymérase Chain Réaction) les produits étaient bien amplifiés et épurés (Sambrook et al, 1989)

Analyse séquentielle de l’arbre phylogénétique L’identification des séquences est réalisée par la comparaison avec les séquences déjà connues. l’analyse phylogénétique par le logiciel ARB(Ludwig et al,2001) Le calcul des arbres n’a considéré que les ordres à point d’ébullition de 1300. Les ordres les plus courts ont été rajoutés à l’arbre final