APPLICATIONS PRATIQUES DE LA TECHNIQUE DE PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL Congrès ATC 2012 Myriam SEJOR Laboratoire de Cytogénétique Service du Pr B. BENZACKEN Hôpital Jean VERDIER

La PCR quantitative en temps réel INTRODUCTION A l’heure où la cytogénétique moléculaire se rapproche de la biologie moléculaire avec l’utilisation des puces à ADN, les méthodes de quantification de l’ADN à des locus spécifiques se sont considérablement développées. La PCR quantitative (PCRq), aussi appelée PCRq en temps réel, était initialement essentiellement utilisée en biologie moléculaire pour étudier et quantifier gènes. En Cytogénétique, on s’y intéresse comme méthode de quantification de l’ADN génomique pour confirmer des anomalies détectées en ACPA (notamment des anomalies de petite taille non confirmées en FISH, et plus particulièrement les duplications).

Principe de la PCRq ~ 35 cycles Les trois étapes d’un cycle de PCR: Dénaturation 95°C 1 min Hybridation 55-60°C 1 min Élongation 72°C 1 min ~ 35 cycles L’amplification d’une séquence d’ADN suit 3 étapes: Dénaturation de l’ADN double-brin (95°C) Hybridation ou appariement des amorces (~60°C Tm) Synthèse du brin complémentaire par l’ADN polymérase thermorésistante (Taq gold)(72°C)

Principe de la PCRq En PCR classique , le produit amplifié est détecté lorsque les cycles de PCR sont terminés. La PCR quantitative détecte et mesure l’accumulation du produit amplifié au cours de la réaction (détection rendue possible en ajoutant une molécule fluorescente au mélange réactionnel). Le thermocycler mesure une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié à chaque cycle.

Chimie SYBR Green Fluorochrome s’intercalant spécifiquement dans l’ADN double brin nouvellement synthétisé. Sous une excitation UV, émet un signal de fluorescence dont la mesure permet de quantifier l’ADN double brin.

Autre marqueur fluorescent Sonde fluorescente spécifique: La technologie TaqMan®

Cycles de la PCRq

Principe de la PCR Augmentation du nombre d’amplicons (produits de PCR) selon une exponentielle d’ordre 2 (2n)  droite en échelle logarithmique jusqu’à épuisement des réactifs (dNTP, amorces…)  plateau

La valeur Ct cycle seuil ou « threshold cycle » Une ligne seuil d’intensité de fluorescence est déterminée arbitrairement (au-dessus du bruit de fond) de façon à ce qu’elle coupe la courbe d’amplification dans la phase exponentielle de la PCR. Ct Ct

La valeur Ct cycle seuil ou « threshold cycle » Plus quantité ADN diminue Plus Ct augmente. Donc le Ct est inversement proportionnel au nombre de copies d’ADN initiales à amplifier, d’où l’aspect quantitatif de la PCRq. Le Ct est reproductible.

La quantification relative Détermination du nombre de copies d’un gène d’intérêt cible relativement au nombre de copies d’un gène de référence. Gène de référence: PTEN sur le chromosome 10 Gène servant de Contrôle interne: gène du facteur IX (F9) sur le chromosome X. Un témoin masculin et un témoin féminin.

La quantification relative La méthode de calcul utilisée par le logiciel StepOne™ est la méthode des DDCt : Méthode des DDCt : Ct gène cible – Ct gène de référence = DCt DCt patient – DCt témoin = DDCt Variation de 2-DDCt Livak et al 2001, Methods

Choix des amorces Amorce: petites séquences oligonucléotidiques (~20b) bornant la séquence cible à amplifier. Utilisation de plusieurs sites informatiques de bases de données: Site Database of Genomic Variants (DGV) Site Ensembl Site NCBI logiciel PrimerBlast

Choix du gène cible sur DGV Localisation de la séquence cible, trouvée anormale en ACPA. Choix du gène qui paraît le plus pertinent.

Choix des séquences sur Ensembl ADN génomique du gène cible. Distinction exons/introns. Possibilité de choisir des séquences contenant des exons pour le choix des amorces.

Choix des amorces par PrimerExpress Logiciel recherchant les 50 meilleures combinaisons de paires d’amorces (« forward » et « reverse »), à partir de la séquence cible choisie. Sélection des amorces ne comportant pas (dans la mesure du possible): Configuration en « hairpin » ou épingle à cheveux Formation de « self-dimer » et « cross-dimer »

Spécificité des amorces sur PrimerBlast (NCBI) Vérification de la fixation spécifique de la paire d’amorces choisie sur la séquence cible. PrimerBlast permet de savoir si les amorces ne se fixent pas ailleurs sur le génome humain.

Test d’efficacité des amorces par PCRq Gamme d’étalonnage en cinq points faite avec un ADN témoin. PCR réalisée en duplicate. Élaboration d’un plan de manipulation (plaque de 96 puits). Appareil à PCRq en temps réel: StepOne Plus™. Efficacité acceptée entre 90% et 125%.

Technique de PCRq PCRq faite pour le patient et pour ses parents en même temps: détermine caractère de novo ou hérité de l’anomalie. Chaque échantillon d’ADN (patient, parents, témoins M et F) fait en triplicate. ADN dilué à 5 µM. Gène de référence PTEN. Gène de contrôle interne F9. Puits contrôle négatif en duplicate. Élaboration d’un plan de technique (plaque de 96 puits). Feuille de calcul des Mix de PCR.

Technique de PCRq Appareil PCRq StepOne Plus™. Durée de la PCRq: 2h30. Résultats analysés par le logiciel de l’appareil. Résultats sous forme de courbes, graphes et diagrammes.

Cas Pratique: Duplication Enfant de 8 ans (garçon) Clinique: omphalocèle, malformations ophtalmologiques Caryotype normal Résultat ACPA : duplication en 3p26.3 Taille : 413 kb

Résultat ACPA

Gène cible sur DGV

Test d’efficacité des amorces

Résultat PCRq Patient Mère Père Vérification de la qualité de la PCRq sur gène gonosomique (F9). PCRq sur gène autosomique (PTEN). Patient Mère Père

Cas Pratique : Délétion Enfant de 13 ans (fille) Clinique: Psoriasis, hypotrophie, retard de croissance, paraplégie spastique Caryotype normal Résultat ACPA : délétion en 13q12.11 Taille : 80 kb délétion non visible en technique de FISH

Résultat ACPA

Gène cible sur DGV

Test d’efficacité des amorces

Résultat PCRq Patient Mère

Cas Pratique : Triplication Enfant de 10 ans (fille) Clinique: dysmorphie, retard psychomoteur Caryotype normal Résultat ACPA : triplication en 12p12.3 Taille : 1,3 Mb

Résultat ACPA

Gène cible sur DGV

Test d’efficacité des amorces

Résultat PCRq Patient Mère Père

Avantages Difficultés Test en une seule fois du patient et des parents Meilleure résolution que la FISH pour les duplications Rapide (partie analytique) Reproductible Spécifique du gène cible Ne nécessite que de petites quantités d’ADN du patient (200ng/patient) Mise au point et commande de nouvelles amorces pour chaque anomalie à vérifier Partie pré-analytique longue Nécessité de réplicas Peu de patient par plaque de PCR (96 puits) (deux familles au max)

Remerciements Pr Brigitte BENZACKEN, chef de service Dr Andrée DELAHAYE (PCRq) Dr Eva PIPIRAS (ACPA) Toute l’équipe technique du laboratoire: Evelyne, Céline, Nathalie, Véronique et Jean.

Merci de votre attention