Thierry Fouquet 9 septembre 2009 Distinction isomérique et quantification de monosaccharides par la méthode cinétique 1 Méthodes et modèles Pôle Méthodes et Modèles Universités Aix-Marseille I, II & III - CNRS, UMR 6264 Laboratoire Chimie Provence Spectrométries Appliquées à la Chimie Structurale

Plan Introduction : méthode cinétique Objectifs Résultats Systèmes discriminants Quantification en mélange binaire Non linéarité : observations et origine Correction Quantification en mélange ternaire Perspectives 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles

Cooks, R. G. ; Wong, P. S. H. Kinetic method of making thermochemical determinations : Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 1998, 31, Introduction – Méthode cinétique standard Méthode relative approchée pour la détermination de propriétés thermochimiques en spectrométrie de masse Mesure des cinétiques de dissociations compétitives dun complexe simplement chargé k2k2 réf --- C + réf 1 … réf n H r 1 … H r n A --- C + réf --- C + A --- C + réf --- C A C +, réf A ESI k1k1 CID réf --- C + ---A 3

Augusti, D. V.; Carazza, F.; Augusti, R.; Tao, W. A.; Cooks, R. G. Quantitative chiral analysis of sugars by electrospray ionization tandem mass spectrometry using modified amino acids as chiral reference compounds. Anal. Chem. 2002, 74, Méthode cinétique (2) Appliquée à la distinction énantiomérique Discrimination par la différence dinteractions entre deux énantiomères dans un environnement chiral Appliquée à la distinction isomérique Même procédé Utilisée pour la distinction de peptides réfM 2+ AiAi réf - H + énantiomère i énantiomère j RiRi caractéristique de A i métal divalent référence chirale ratio en mélange 4 AiAi CID k1k1 k2k2 réfM 2+ A - H + réfM 2+ réf - H + ESI M 2+, réf i i Fraction molaire Wu, L.;Cooks, R. G. Chiral and isomeric analysis by electrospray ionization and sonic spray ionization using the fixed-ligand kinetic method. Eur. J. Mass Spectrom. 2005, 11,

Objectifs Distinction isomérique de trois monosaccharides par la méthode cinétique : 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles Biomasse Biocarburants Principes actifs Vecteurs Stockage dénergie Reconnaissance cellulaire D-glucoseD-galactoseD-fructose Quantification en mélanges binaires et ternaires Démonstration du potentiel de la méthode Intérêts : Di-, tri- et oligosaccharides

Systèmes discriminants métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose système discriminant = métal + référence métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose métal (II) CaMnFeCoCuZn référence L - Asp L - Thr L - Ser L - Phe L - Asn L - Gln L - Glu L - Arg D - fucose trimère non formé trimère formé : fragmentation secondaire trimère formé : - réf majoritairement trimère formé : - sucre majoritairement trimère formé : dissociations compétitives Mn/Asp et Cu/Ser choisis pour la quantification 09/09/ coordinationenvironnement asymétrique T. FouquetMéthodes et modèles

Quantification en mélange Mélange binaire gal/fru fru/glc gal/glc non linéarité calibration 2 points (loi linéaire) Calibration 5 points quantification accessible système Cu/Ser 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles i i

Une origine de la non linéarité Compétition entre analytes pour la formation/ionisation des clusters Illustration : abondance dun cluster trimérique mesurée en MS 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles

Correction Une origine de cette non linéarité Compétition entre analytes pour la formation des clusters trimériques Equilibre entre phase liquide et phase gaz proposé par Zhang et al. relation rationnelle entre et 9 Zhang, M. Y.; Kerns, E.; McConnell, O. Observation of enantiomeric formation of trimeric complex ions [CuII(Phe)(Pro)2-H]+ using ESI. In Proceedings of the 51st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Montreal, Quebec, Canada, June ratio mesuré fraction molaire en phase liquide

Correction (2) Régression rationnelle trois points (0, 50 et 100%) obtention des coefficients rapports des constantes déquilibre corrélation satisfaisante gal/fru fru/glc gal/glc 2,33 0,87 2,51 coefficients propres à un isomère dans un mélange binaire pour un système métal/référence 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles

Quantification Mélange ternaire Fonction rationnelle de deux fractions molaires influence de k sur i dans le mélange i/j/k influence de k sur j 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles

Simplification : Utiliser les coefficients correcteurs obtenus en mélange binaire On évite une nouvelle calibration Trois valeurs obtenues par fraction (k=fru, gal, glc) Moyenne arithmétique fraction molaire mesurée fraction molaire en phase liquide % (σ) a réelle valeurs calculées k = fru gal glc fru 33 35,2 32,0 32,8 fraction molaire en phase liquide % (σ) a réelle valeurs calculées k = fruk = glc gal glc fru 33 35,2 32,0 32,8 31,8 33,6 34,6 fraction molaire en phase liquide % (σ) a réelle valeurs calculées k = fruk = glck = gal gal glc fru 33 35,2 32,0 32,8 31,8 33,6 34,6 32,7 36,1 31,2 fraction molaire en phase liquide % (σ) a réelle valeurs calculées moyenne arithmétique k = fruk = glck = gal gal glc fru 33 35,2 32,0 32,8 31,8 33,6 34,6 32,7 36,1 31, (0.5) 34.0 (1.0) 32.8 (0.9) Fouquet, T. ; Charles, L. Distinction and quantitation of sugar isomers in ternary mixtures using the kinetic method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. accepted for publication Quantification (2) fraction molaire en phase liquide % (σ) a réelle gal glc fru 33 Binaire i/k k compétiteur j spectateur Binaire j/k k compétiteur i spectateur Un exemple : 12 i/j/k = i/j + j/k + i/k Correction en mélange binaire Correction en mélange ternaire

Perspectives Plus disomères en mélange Talose, mannose Fragmentation de clusters dimériques [M(réf)(A)] + Augmentation de la plage de mesure Détection et/ou mesure de traces Complexification des sucres étudiés Di-, tri- et oligosaccharides 09/09/ T. FouquetMéthodes et modèles

Remerciements 09/09/ Le Spectropôle pour laccès privilégié aux instruments Laurence Charles pour toute laide apportée Et toutes les personnes du laboratoire sans distinction dâge, pour toutes les choses aussi diverses que variées quelles ont pu apporter, conseils pour les manipulations, remarques, propositions, café, cigarettes, idées saugrenues et sans aucun débouché, railleries… T. FouquetMéthodes et modèles

09/09/2009 T. FouquetMéthodes et modèles 15 Merci de votre attention

21/09/2009 T. Fouquet M2R CISA (Aix-Marseille III) – Ecole Centrale Marseille méthode cinétique pour la distinction isomérique 16

21/09/2009 T. Fouquet M2R CISA (Aix-Marseille III) – Ecole Centrale Marseille méthode cinétique pour la distinction isomérique 17

21/09/2009 T. Fouquet M2R CISA (Aix-Marseille III) – Ecole Centrale Marseille méthode cinétique pour la distinction isomérique 18

Cooks, R.G. ; Koskinen J. T. ; Thomas P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 1999, 34, Méthode cinétique (3) Hypothèses sous-jacentes variation d entropie négligée « acceptable » si : similitude structurale et fonctionnelle entre analytes et références absence d interactions intramoléculaires pas d isomères du cluster trimérique source derreurs dans la mesure de propriétés thermochimiques Indépendance de formation des clusters pas dinfluence dun analyte j sur un analyte i 19