des glucides avec les lipides (glycolipides) Les complexes des glucides avec les lipides (glycolipides) des glucides avec les protéines (glycoprotéines, glycosaminoglycanes) 2ème partie : les glycoprotéines Pr Jean Luc OLIVIER 2013-2014

Plan du cours 1- Les glycolipides 2- Les glycoprotéines 1.1. structure générale 1.2. synthèse et dégradation 1.3. Fonctions physiologiques et implication en pathologie: exemples 2- Les glycoprotéines 2.1. structure générale O- et N-glycosylation Les différentes chaînes osidiques 2.2. synthèse et dégradation Processus de glycosylation des protéines Rôles du réticulum et du golgi Dégradation des glycoprotéines, rôle des lysosomes 2.3. Fonctions physiologiques et implication en pathologie 2.1. structure générale 2.2. synthèse et dégradation 2.3. Fonctions physiologiques et implication en pathologie: exemples 3- Les glycosaminoglycanes et protéoglycanes 3.1. structure générale 3.2. synthèse et dégradation 3.3. Fonctions physiologiques et implication en pathologie: exemples

Structure générale: composition des chaines glucidiques Les glycoprotéines Structure générale: composition des chaines glucidiques Glycoprotéines = protéines avec chaînes osidiques Beaucoup de protéines sont des glycoprotéines Grande diversité: protéines solubles, protéines membranaires Fonctions très diverses: enzymes, hormones, protéines de transport, Grande diversité des chaînes osidiques, 8 oses principalement représentés: Galactose (Gal) Glucose (Glc) Mannose (Man) Acide N-acétyl-neuraminique (sialique) (NeuAc) Fucose (Fuc) N-Acétylgalactosamine (GalNAc) N-acétylglucosamine (GlcNAc) Xylose (Xyl) A quoi servent ces chaînes osidiques ? Pourquoi sont elles très diverses?

Structure générale: N- et O- glycosylations Les glycoprotéines Structure générale: N- et O- glycosylations Les chaînes glucidiques sont fixées aux protéines par l’intermédiaire des résidus Asparagine (liaison N-glycosidique) ou des résidus Ser et Thr (liaison O-glycosidique) Liaison N-glycosidique GlcNAc -Asn-X-Ser/Thr -Ser ou Thr Liaison N-glycosidique: le sucre est fixé à l’Asn sur l’atome d’ azote du gr amide. Asn accepte le sucre si elle fait partie de la séquence Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr: ceci est un site potentiel de glycosylation mais çà ne signifie pas que chaque séquence de ce type sera glycosylée. La glycosylation effective dépend aussi d’autres caractéristiques de la protéine et du type cellulaire dans lequel elle est exprimée. Noyau pentasaccharidique commun à toutes les protéines N glycosylées O-glycosylation: le sucre est attaché à l’atome d’oxygène de la chaîne latérale de la ser ou la thr Transition: sur la 1° diapo vous avez vu que les chaines glucidiques fixées sur la protéine prennent la forme de ramifications, d’arborisations qui peuvent être volumineuses. En fait elles ont des antennes qui peuvent donc avoir un volume important. Nous allons voir ceci sur une autre image. Liaison O-glycosidique GalNAc

Structure: les chaines N-glycosidiques Les glycoprotéines Structure: les chaines N-glycosidiques Il y a 3 types de chaînes N-glycosidiques, avec un noyau constant Man Asn GlcNAc Sia Gal complexes Man Asn GlcNAc Gal hybrides riches en mannose Man Asn GlcNAc Comment (et où) sont synthétisées/transférées ces chaines osidiques?

Les glycoprotéines Structure: les chaines O-glycosidiques Il y a aussi un noyau constant dans les chaînes O-osidiques (branchement sur Ser ou Thr) Galβ1,3GalNACαSer/Thr Ser/Thr GalNAc Gal Galactose (anomère β) β 1 ↓ 3 N-Acétyl galactosamine (anomère α)

Synthèse: les chaines N-glycosidiques Les glycoprotéines Synthèse: les chaines N-glycosidiques La N-glycosylation des protéines commence dans le réticulum endoplasmique pendant que la protéine est synthétisée 5’P 3’OH N C Asn Chaine osidique ARNm Réticulum endoplasmique (rugueux) Cytosol

Les glycoprotéines Synthèse: les chaines N-glycosidiques La synthèse et le transfert des chaînes N-osidique se font grâce à un lipide: le dolichol C = C–C–C–C=C–C–C–C–C–C–O–P–P–O–GlcNAc–GlcNAc–Man H CH3 3HC 15-18 Man 2 3 Glc Man=Mannose GlcNAc=N-acétyl glucosamine Motif isoprène Groupe pyrophosphate Dolichol et ose activé par nucléotides Chaine osidique Lipide dérivé du cholestérol Répétition du motif isoprène) Une chaîne de composition toujours identique est synthétisée

Synthèse: les chaines N-glycosidiques Les glycoprotéines Synthèse: les chaines N-glycosidiques La chaîne osidique comportant NAcGlc, Man et Glc est transférée d’un bloc du dolichol à l’asparagine de la protéine 5’P 3’OH N C Asn ARNm Réticulum endoplasmique (rugueux) Cytosol P 5’P 3’OH N C Asn ARNm Réticulum endoplasmique P N-acétyl- glucosamine Mannose Ca ne signifie pas que tous les Asn sont glycosylées. C’est une séquence consensus mais la glycosylation dépend aussi de la conformation, du type cellulaire… La glycosylation dépend de la structure secondaire de la protéine… Glucose Site « consensus » Asn-X-Ser/ Thr , X≠ Pro, Asp, Glu

Synthèse: les chaines N-glycosidiques Les étapes ultérieures Les glycoprotéines Synthèse: les chaines N-glycosidiques Les étapes ultérieures Action de glycosidases pour enlever les glucoses et certains mannoses Action de glycosyl-transférases pour ajouter différents oses Formation des chaînes les plus complexes RESULTATS - Une protéine peut comporter plusieurs site de glycosylation (ser/ther ou Asn-X-Ser) avec des chaînes différentes - Un même site dans une protéine donnée peut porter des chaînes différentes dans différents types cellulaires ou dans un type cellulaire selon l’environnement de la cellule ou le moment

Géographie intracellulaires de la synthèse des chaines N-glycosidiques Les glycoprotéines Géographie intracellulaires de la synthèse des chaines N-glycosidiques Les chaînes N- et O-osidiques sont synthétisées à partir de sucres complexés avec des nucléotidiques (UDP ou GDP) Réseau trans golgi: sulfatation Citerne médiane: Addition de GlcNAc Citerne trans: addition de Gal et Sia Citerne cis et médiane: Enlèvement des Mannoses Après le contrôle de qualité dans le RE, la N-GP passe par transport vésiculaire du RE vers le Golgi. Des lectines sont nécessaires à ce transport. La maturation golgienne implique une: 1- démannosylation, suivie par l’addition de GlcNAc, de Gal, d’acide sialique, de fucose . (dans citernes trans et trans golgi network) Elle transforme les les N glycanes en structures complexes comprenant un pentasaccharide central sur lequel des antennes sont greffées, formées de GlcNAc, Gal, NeuAc, Fuc mais dépourvus de Glucose. La sulfatation des oligosaccharides se déroule en dernier, c’est la dernière étape de modification des oligosaccharides et elle se fait sur des résidus tyrosine. Réseau cis Golgi (cis Golgi network): Phosphorylation des Mannoses

Les glycoprotéines Synthèse: les chaines O-glycosidiques Il y a aussi un noyau constant dans les chaînes O-osidiques (branchement sur Ser ou Thr) Galβ1,3GalNACαSer/Thr Ser/Thr GalNAc Gal Galactose (anomère β) β 1 ↓ 3 N-Acétyl galactosamine (anomère α) La O-glycosylation est plus simple et se déroule dans le Golgi

Les glycoprotéines Mécanisme de diversité et spécificité de la synthèse des chaines osidiques Les chaînes osidiques des glycoprotéines et glycolipides portent un message (une fonction) La diversité des fonctions et leur spécificité est le produit de la diversité des chaines osidiques Comment assurer diversité et spécificité? Pas de matrice à copier (ADN, ARN) La synthèse des chaînes osidiques est assurées par des glycosyl-transférases des glycosidases (quand certains oses sont enlevés)

Les glycoprotéines Mécanisme de diversité et spécificité de la synthèse des chaines osidiques Une glycosyl transférase branche un ose donné sur un anomère accepteur donné avec un type de liaison donnée Mécanismes de spécificité des glycosyl transférases 1- Le niveau d’expression des glycosyl-transférases différent suivant le type cellulaire, Coordination possible du niveau d’expression d’une glycosyl- transférase avec son substrat 2- spécificité pour la protéine ou le peptide: seulement une minorité d’enzymes, reconnaissance du site de glycosylation sur la protéine 3- séquestration: la conformation de la protéine (et de la chaîne osidique acceptrice restreint l’accès de la chaîne à certaines transférases

Les glycoprotéines Exemple de l’hormone HCG et d’une glycosyl-transférase peptide-spécifique L’hormone chorio-gonadotrophique (HCG) intervient dans l’évolution de la grossesse (détection de la grossesse) et comporte 2 chaînes α et β qui sont N-glycosylées N-acétylgalactosamine (β 1 → 4) N-Acétyl-Galactosamine transférase des hormones glycoprotéiques H2N Pro-X-Arg/Lys Asn-X-Ser COOH 9 ac. am. Mutation des acides aminés Suppression de l’action de la Nac-Gal transférase

Dégradation des glycoprotéines: rôle des lysosomes Les glycoprotéines Dégradation des glycoprotéines: rôle des lysosomes Les lysosomes sont des organites de dégradation (pH intérieur acide) des molécules ou complexes moléculaires à l’intérieur de la cellule. Ils sont formés à partir du golgi et contiennent les enzymes de dégradation (hydrolases) agissant à pH acide exocytose Les chaînes osidiques sont dégradées par des exo et endo-glycosidases. Les groupes sulfates sont éliminés par des sulfatases

Fonctions physiologiques et implication en pathologie Les glycoprotéines Fonctions physiologiques et implication en pathologie Fonctions des chaînes osidiques des glycoprotéines: Reconnaissances antigéniques Reconnaissances cellules hôtes-agents infectieux Reconnaissance intercellulaires Reconnaissance récepteur-ligand Modulation de l’activité enzymatique La diversité des fonctions et leur spécificité est le produit de la diversité des chaines osidiques

Fonctions physiologiques et implication en pathologie Les glycoprotéines Fonctions physiologiques et implication en pathologie exemple des virus influenza (grippe) CH3 C O H OH HN HOCH2 COO- Acide sialique ou N-acétyl neuraminique Une protéine d’enveloppe (hémagglutinine) des virus de la grippe reconnaît l’acide sialique des glycoprotéines de la cellule hôte (liaisons hydrogènes)

Implication en pathologie : exemple des virus des grippes Les glycoprotéines Implication en pathologie : exemple des virus des grippes Les chaines glucidiques sont propres aux espèces: le changement d’affinité de l’hémagglutinine des virus influenza explique le passage d’une espèce à une autre N-acétyl- glucosamine Galactose Acide N-acétyl- neuraminique (sialique) α 2 → 6 α 2 → 3 Reconnaissance Hémagglutinine virus aviaire Reconnaissance Hémagglutinine virus humain

Fonctions physiologiques des glycoprotéines Régulations des activités enzymatiques, exemple de la LCAT Les hétéropolysaccharides conjugués aux protéines et lipides Rôle des chaînes osidiques: Exemple de la LCAT Phosphatidylcholines (lécithines) saturé insaturé CH3 O - CH2 - CH2 - N+ CH3 CH2O - CO O CH CH2O- P O- CO - = O lysoPC Albumine Foie sang : Lécithine Cholestérol Acyl-Transférase (LCAT) Cholestérol Non estérifié Cholestérol estérifié H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 18 19 23 16 17 24 25 26 27 21 20 22 A B C D C-O O = Les chaînes oligosaccharidiques peuvent être très volumineuses. S’il s’agit d’une protéine membranaire, les oligosaccharides font protrusion à l’extérieur et peuvent masquer des antigènes de surface. Ils peuvent ainsi empêcher des molécules de venir adhérer à la cellule ou soustraire la cellule à la surveillance immunologique. Ces altérations des chaînes oligasaccharidiques sont des caractéristiques universelles des cellules cancéreuses. Ceci permet de situer le sujet et de comprendre pourquoi il est utile de comprendre comment les protéines sont glycosylées.

↓90% (10% de l’activité initiale) Fonctions physiologiques des glycoprotéines Régulations des activités enzymatiques, exemple de la LCAT 4 sites de N-glycosylation Glucides = 25% de la masse totale de l’enzyme Effets des chaînes glycosidiques sur l’activité enzymatique de la LCAT H2N COOH 20 84 272 384 1 416 ↓18% ↓62% ↓82% ↑200% Mutation Mutation des 4 sites ↓90% (10% de l’activité initiale) Karmin O et coll. 1993 Biochem J, 294, 879-884

Les glycoprotéines Conclusions Beaucoup de protéines sont des glycoprotéines Il existe deux types de liaisons des chaînes glycosidiques aux protéines, les N- et O-glycosylations Il existe une grande diversité des chaines osidiques des glycoprotéines mais il existe des « noyaux » constants La diversité de fonctions biologiques reposent sur la diversité des chaines osidiques La diversité et spécificité des chaines osidiques reposent sur le rôle des glycosyltransférases et glycosidases mais les mécanismes sont encore mal connus