Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire 7-8 septembre 2006 Faculté de Pharmacie, Marseille “Biomolécules” Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires Roselyne GARNOTEL Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, CNRS UMR 6198, UFR Médecine, IFR 53 Biomolécules, Reims

INTRODUCTION

Interactions collagènes/cellules sanguines polynucléaire neutrophile ou monocyte COMPARTIMENT INTRAVASCULAIRE 1. Recrutement cellules endothéliales 3. Diapédèse 2. Adhésion membrane basale ou collagène IV collagène I MATRICE EXTRACELLULAIRE ± MODIFIEE 5. Explosion respiratoire (DGGRYY sur a1CB6) Libération de MMPs 4. Contact collagène/cellules sanguines (RGD)

Le collagène de type I Demi-vie : 15 ans télopeptide N-terminal télopeptide C-terminal zone hélicoïdale ( triple hélice ) DGGRYY RGD Demi-vie : 15 ans

Les cellules inflammatoires Les polynucléaires neutrophiles : principales cellules de défense de l’organisme sont impliqués dans les réponses inflammatoires, la phagocytose bactérienne… Les monocytes : sont impliqués dans les réponses inflammatoires et la production de cytokines régulatrices sont transformés en macrophages tissulaires qui sont les cellules pivot de l’inflammation chronique sont en contact du collagène I, le composant majoritaire de l’espace sous-endothélial

Les récepteurs de type intégrine Famille des intégrines Structure des intégrines b2

La NADPH oxydase MEMBRANE PLASMIQUE p22 phox gp91phox CYTOSOL O2- O2 p21 rac GTP p47 phox p67 phox p40 phox P CYTOSOL p47 phox p21 rac GDP GDI p67 phox p40 phox GDI

Les métalloprotéinases matricielles - dégradent au moins un des composants de la matrice extracellulaire - sont synthétisées sous forme latente appelée proMMP - nécessitent une activation extracellulaire par clivage du prodomaine - contiennent un site de liaison au zinc dans le domaine catalytique - sont inhibées par les TIMPs (inhibiteurs spécifiques tissulaires) sont divisées en familles dont une est celle des gélatinases (A et B, ou MMP-2 et MMP-9 )

Les métalloprotéinases matricielles peptide signal pro-peptide domaine catalytique Structure primaire des gélatinases région charnière domaine hémopexine domaine fibronectine type II Zn2+

La cascade protéolytique t-PA TIMPs a2-macroglobuline PAIs u-PA plasminogène plasmine pro-collagénase (proMMP-1) pro-stromélysine (proMMP-3) Stomélysine (MMP3) collagénase (MMP1) pro-gélatinase B (proMMP-9) gélatinase B (MMP-9)

L’u-PA (urokinase type-Plasminogen Activator) - fait partie de la famille des Sérine protéinases. - contient un domaine analogue à l’EGF, un domaine « kringle » et un domaine catalytique. - se fixe à un récepteur membranaire (uPAR). EGF Kringle protéinase N C EGF Kringle protéinase S-S N C Simple chaîne (sc-uPA) Double chaîne (tc-uPA) u-PA de haute MM (55 kDa) protéinase S-S N C u-PA de faible MM (30 kDa)

le collagène de type I et cellules inflammatoires Interactions entre le collagène de type I et cellules inflammatoires

Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I

Adhésion des polynucléaires au collagène de type I Activation des polynucléaires au contact du collagène I avec libération de radicaux libres oxygénés exocytose des granules Implication de l’intégrine LFA-1 ou aLb2 ou CD11a/CD18 Mise en évidence des voies de transduction impliquées CAS CAS pepsiné GARNOTEL, R, MONBOISSE, J.C., RANDOUX, A., HAYE, B., BOREL, J.P. The binding of type I collagen to LFA-1 integrin triggers the respiratory burst of human polymorphonuclear neutrophils. Role of calcium signalling and tyrosine phosphorylation of LFA-1. J. Biol. Chem., 1995, 270, 27495-27503.

Interactions entre les monocytes et le collagène de type I

Adhésion des monocytes au collagène de type I Activation des monocytes au contact du collagène I avec libération de radicaux libres oxygénés Implication de l’intégrine gp150/95ou aXb2 GARNOTEL, R., RITTIE, L., POITEVIN, S., MONBOISSE, J.C., NGUYEN, P., MAQUART, F.X., RANDOUX, A., GILLERY, P. Human blood monocytes interact with type I collagen through axb2 integrin (CD11c-CD18, gp 150-95). J. Immunol., 2000, 164, 5928-5934. uPA Plasminogène -----> plasmine pro-MMP9 -----> MMP9 MMP uPA cytokines

Libération de pro-MMP9 et d’uPA Activation de la pro-MMP9 en MMP9 LMW uPA Time (h) Plastic Type I collagen 6 24 48 6 24 48 HMW uPA Time (h) Plastic Type I collagen 6 24 48 6 24 48 MMP-9 Pro-MMP9 Libération de pro-MMP9 et d’uPA Activation de la pro-MMP9 en MMP9 TNF-a IL-1b IL-6 Libération d’IL-6, IL-1b et TNF-a

Implication de NF-KB PDTC 100 µM NAC 10 mM Curcumin 50 µM Control Pro-MMP9 HMW uPA LMW uPA Plast Coll 1 h 2 h 3 h Hetero-dimers Homo-dimers 1 2 3 C PD NA CU Implication de NF-KB

Les principales modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire

Modifications post-traductionnelles des proteines Fixation non enzymatique de métabolites simples Oses et dérivés : glycation Urée et dérivés : carbamylation Dérivés lipidiques ou de glycation : oxydation Remaniements moléculaires Altérations structurales et fonctionnelles des protéines Mécanismes de maturation / vieillissement impliqués en pathologie

Pathologies « post-traductionnelles » Athérosclérose Oxydation Diabète Glycation Oxydation Vieillissement physiologique Glycation Oxydation Insuffisance rénale Carbamylation

Glycation / glycoxydation non enzymatique Réaction chimique entre : groupement NH2 (a-NH2 terminal ou e-NH2-lysine d’une protéine ose simple (glucose) Réaction générale : In vitro : « brunissement des protéines » « réaction de Maillard », 1912 In vivo : diabète (1960), vieillissement physiologique et autres pathologies (1980) toutes les protéines Réaction spontanée, irréversible et cumulative (durée de vie)

Glycation / glycoxydation Base de Schiff Glucose + Protéine Produits d’Amadori Oxydations, Clivages, Pontages Produits intermédiaires (aldéhydes réactifs) Produits avancés de la glycation («advanced glycation end products» ou «AGE» ou «Produits de Maillard») Pontages, Altérations….. Glycation + Oxydation = Glycoxydation

Carbamylation La carbamylation est une modification post-traductionnelle non enzymatique des protéines, par fixation d’acide isocyanique provenant de la décomposition de l’urée NH2 C O NH4+ + Urée Cyanate - N HN R N H Acide Isocyanique Protéine (Lysine -NH2) Protéine carbamylée (Homocitrulline)

Carbamylation des protéines Augmentation dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) Perte de la fonction des protéines Impliquée dans des réactions délétères LDL carbamylées (Athérosclérose au cours de l'IRC) Collagène carbamylé (Athérosclérose, inflammation et infection au cours de l'IRC)

Rôle central de la matrice extracellulaire en pathologie Les fonctions des cellules sont modulées par des stimuli provenant d’autres types cellulaires, mais aussi d’interactions spécifiques avec les protéines de la matrice extracellulaire (MEC). Les protéines de la MEC sont particulièrement sujettes aux modifications post-traductionnelles, en raison de leur longue durée de vie. Les interactions cellules – matrice ne peuvent se concevoir sans prendre en compte ces modifications.

le collagène de type I modifié et cellules inflammatoires Interactions entre le collagène de type I modifié et cellules inflammatoires

La carbamylation du collagène de type I

Collagène de type I (tendons de queues de rat) incubé pendant 2, 6 et 24 heures à 37°C dans un tampon phosphate 0,15 M (pH 7,4) contenant 0,1 M KCNO Taux de carbamylation du collagène I Hydrolyse acide (HCl 6 M – 18 h à 110°C) Analyse de la composition en acides aminés 11 16 Carb 24h 4 23 Carb 6h 2 25 Carb 2h 27 Témoin Homocitrulline Lysine Résultats exprimés en nombre de résidus pour 1000 Mobilité électrophorétique SDS-PAGE 5% 1(I) - 2(I) - T2h C2h T6h C6h T24h C24h Modifications de la composition en acides aminés et de la migration électrophorétique

Modifications de l’aspect du réseau de fibres formé Carb 2h 10 µm Carb 6h 10 µm Témoin 10 µm Carb 24h 10 µm Modifications de l’aspect du réseau de fibres formé par le collagène carbamylé

Electrophorèse Bidimensionnelle Clivage du collagène témoin ou carbamylé 6 h par le bromure de cyanogène (CNBr) Analyse des peptides par SDS-PAGE 12,5 % (Mono- et Bidimensionnelle) Electrophorèse 1D Electrophorèse Bidimensionnelle 1(CB6) - Témoin Carb 6h pHi : 3 10 Témoin Carb 6h 2(CB3-5) - 2(CB4) - 1(CB7-8) - 1(CB6) - 1(CB3) - Mise en évidence de la carbamylation du peptide a1CB6

Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I carbamylé

Inhibition de l’activation des PNN par le collagène I carbamylé Chaque puits (32mm²) est recouvert par 25 µg de collagène témoin ou carbamylé Incubation des PNN pendant 2 heures à 37°C – Réduction intracellulaire du NBT (Abs 560 nm) Réduction du NBT (Abs 560 nm) Plastique Coll Témoin + fMLP 10-7 M Coll Témoin Coll Carb 2h Coll Carb 6h Coll Carb 24h Inhibition de l’activation des PNN par le collagène I carbamylé

La carbamylation du peptide a1CB6 entraîne l’inhibition SDS-PAGE 12,5% ADHESION ACTIVATION Carb 6h Témoin Carb 6h Pepsiné Incubation : 30 min Western Blot Anti-CD11a, CD11b et CD18 Témoin Carb 6h Pepsiné Incubation : 1h Réduction du NBT MM Témoin Pepsiné 1(CB6) Coloration au Bleu Coomasie R250 La carbamylation du peptide a1CB6 entraîne l’inhibition de l’activation des polynucléaires

Mesure de l’adhésion des PNN au collagène carbamylé en présence d’anticorps anti-LFA-1 (coloration au violet cristal) Collagène Sans anticorps IgG1 Contrôle Anti-CD11a Anti-CD18 Collagène Témoin 0,182 ± 0,014 0,171 ± 0,008 0,110 ± 0,012 ** 0,047 ± 0,021 ** Collagène Carbamylé 2h 0,196 ± 0,037 0,183 ± 0,033 NS 0,133 ± 0,014 * 0,035 ± 0,030 ** Collagène Carbamylé 6h 0,178 ± 0,023 0,160 ± 0,026 NS 0,119 ± 0,024 ** 0,039 ± 0,027 ** Collagène Carbamylé 24h 0,165 ± 0,012 0,162 ± 0,025 NS 0,118 ± 0,027 * 0,012 ± 0,017 ** *: p<0,05 ; ** : p<0,01 Interaction des polynucléaires avec le collagène carbamylé via LFA-1 (CD11a/CD18)

Etude de la phosphorylation de p125FAK suite à un contact entre PNN et collagène carbamylé par Western Blot p125FAK p125FAK P [Y397] - Témoin Carb 24h Temps d’incubation (min) : 2 Inhibition de la phosphorylation de p125FAK suite au contact des polynucléaires avec le collagène carbamylé

CAS CAS carbamylé JAISSON, S., LORIMIER, S., RICARD-BLUM, S., SOCKALINGUM, G.D., DELEVALLEE-FORTE, C., KEGELAER, G., MANFAIT, M., GARNOTEL, R., GILLERY, P. Impact of carbamylation on type I collagen conformational structure and its ability to activate human Polymorphonuclear neutrophils. Chem. Biol., 2006, 13, 149-159. 2 µm 2 µm

Interactions entre les monocytes et le collagène de type I carbamylé

Carbamylation du collagène et monocytes Carbamylation du collagène modifie les fonctions biologiques des cellules inflammatoires GARNOTEL, R., SABBAH, N., JAISSON, S., GILLERY, P. Enhanced activation of and increased production of matrix metaloproteinase-9 by human blood monocytes upon adhering to carbamylated collagen. FEBS Letters, 2004, 563, 13-16.

CONCLUSION

+/- Quel(s) site(s) ? Quelle(s) modification(s) ? Protéine Quel(s) mécanisme(s) ? Quel(s) traitement(s) ? Cellules Quelle(s) fonction(s) ?

Matrice Extracellulaire et Régulations Cellulaires - Reims Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire - CNRS UMR 6198 – Matrice Extracellulaire et Régulations Cellulaires - Reims Pr. Ph. GILLERY – Pr. F.X. MAQUART – Dr. S. JAISSON – Dr. C. DELEVALLEE-FORTE – Dr. N. SABBAH Dr. F. TOURE – Dr. A. SZCZYHEL Centre d’étude des Biomatériaux et Interfaces – INSERM ERM 0203 - Reims Dr. S. LORIMIER IBCP - CNRS UMR 5086 - Lyon Pr. Sylvie Ricard-Blum Unité Médian - CNRS UMR 6142 - Reims Pr. Michel Manfait - Dr. Ganesh Sockalingum - Dr. Grégory Kegelaer