DETERMINATION DE LA STRUCTURE QUATERNAIRE D’UNE PROTEINE (G2E 2006) Une protéine vient d’être purifiée. Pour déterminer la masse molaire de ses sous-unités,

Slides:



Advertisements
Présentations similaires
Lehninger Principles of Biochemistry
Advertisements

TD1 Thermodynamique etc….
Substrats énergétiques
1ère étape: Glycolyse Remarque importante!!!!! G6P
La respiration cellulaire
Chapitre 18 L’ADN (acide désoxyribonucléique) la molécule d’acide nucléique qui dirige le processus de l’hérédité de toutes les cellules eucaryotes.
NEOGLUCOGENESE Par: ANDRIAMIANDRA Elie Nandrianina N°2
Partie 5 : Les systèmes vivants assurent leur activité et maintiennent leur intégrité en utilisant des voies métaboliques variées Sous partie 5-b : L’énergie.
Th1 - Énergie et cellule vivante. Cha p 3 : Utilisation de l'ATP dans la ¢ musculaire. A. Fibre musculaire = ¢ musculaire Leur longueur varie de 1 à 40.
Th3 - Corps humain et santé : glycémie et diabète.
plan  Introduction  Définition  intérêt  Détermination de la séquence en acides aminés I. Préparation de la protéine pour le séquençage: II. Séquençage.
● Animation Pédagogique Saint Julien-Genevois Claude Gaspard CPC ● LA CONSTRUCTION DU NOMBRE ● Sources : ● Les instructions officielles ● Les travaux de.
Chapitre 5 : Des acides aminés aux protéines Chapitre 5 : Des acides aminés aux protéines I. La liaison peptidique II. Les dipeptides Exemple: réaction.
© NTScience.co.uk 2005KS3 Unit 8a Food and Digestion 1 Aliments et Digestion.
Chapitre 7 De l’atome à l’univers. Du plus petit au plus grand.
CINETIQUE ENZYMATIQUE
Des acides aminés aux protéines
Calcul de probabilités
Construction d’une maquette pour un mélange de 4 constituants
CHAP 3 : L’utilisation de l’ATP par la fibre musculaire
Thème 3 – La résistance au mouvement des charges
Les tables de multiplication au ce1 « Une construction réfléchie des tables favorise-t-elle leur mémorisation et leurs transferts ? » DOUARCHE Vaéa.
Thème 5 – Des sources d’énergie portatives
Question. Compléter les phrases suivantes.
EPREUVES HISTOIRE ET GEOGRAPHIE
organisation de l’information génétique sur les chromosomes
Plateforme CountrySTAT Aperçu global de la préparation des tableaux dans la nouvelle plateforme CountrySTAT FORMATION DES POINTS FOCAUX SUR LE SYSTEME.
Logos Logos Phu Phu Phu Phu INFOS Canal KcsA Canal KcsA
Deuxième partie : La courbe d’indifférence
les exigences faire une place significative aux « medical humanities »
Méioses et brassages génétiques
Les bandes de Bollinger
Conclusion Réferences Introduction Résultats Matériel et méthodes
Titre.
Une grande partie des données que nous serons amenés cette année à étudier sera exprimée en unités monétaires. Or, nous le savons, il existe un phénomène.
Conclusion References Introduction Matériel et méthodes Résultats
Stage de Pré-rentrée de Paris VI
Précision d'une mesure et chiffres significatifs
Physiologie humaine Dr Bendaoud I.
Le mécanisme de la photosynthèse
Les atomes.
Glycogénolyse et Glycogénogénèse
La Conclusion.
BTN SERVICE ET COMMERCIALISATON – PRESENTATION DES EPREUVES PRATIQUES 2 ateliers oraux et 1 service d’une table au restaurant.
Plans d’experiences : plans de melanges
Plan PLAN Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
Collège Lionel-Groulx
LES PRINCIPES DE LA THERMODYNAMIQUE
La synthèse de documents
Structure D’une Base De Données Relationnelle
Formules de calculs et Fonctions. Structure des formules de calcul Commencez toujours votre calcul par le signe =, ensuite sans laisser d’espaces, placez.
Les éléments et les composés sont des substances
Le lysozyme.
ACP Analyse en Composantes Principales
Programme financé par l’Union européenne
COURS D’HERMENEUTIQUE
METABOLISME DES AUTRES OSES
Propriétés physicochimiques des protéines
Les calculs stœchiométriques
Une protubérance solaire
2.4 La loi de vitesse d’une réaction chimique
La puissance du transfert d’énergie électrique entre un générateur et un circuit constitué de conducteurs ohmiques dépend-elle de ces conducteurs ohmiques.
Dessinez les diagrammes de Bohr
Plateforme CountrySTAT Aperçu global de la préparation des tableaux dans la nouvelle plateforme CountrySTAT FORMATION DES POINTS FOCAUX SUR LE SYSTEME.
L'équilibre chimique.
Le Cytosquelette.
INTRODUCTION AUX MOLÉCULES ORGANIQUES
Université Dr. Yahia FARES de Médéa Faculté des Sciences Section Sciences de la Nature et de la Vie Master 1 immunologie et maladie infectieuse Module:
Chapitre 1 titre Les protéines.
VARIATION D’ENERGIE LIBRE D’OXYDATION DE NADH,H+ ET DE FADH2
Transcription de la présentation:

DETERMINATION DE LA STRUCTURE QUATERNAIRE D’UNE PROTEINE (G2E 2006) Une protéine vient d’être purifiée. Pour déterminer la masse molaire de ses sous-unités, on réalise une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, après traitement au SDS (SDSPAGE), à côté d’un mélange de polypeptides de masse molaire connue servant d'étalon. La mobilité de ces protéines en fonction de leur masse molaire est donnée (avec une échelle logarithmique) sur la figure 1. Remarque : le SDS sert à dénaturer les protéines afin que le seul critère de séparation soit leur taille (sans ce traitement, la structure tridimensionnelle pourrait influencer la vitesse de migration) Figure 1 : masse molaire des protéines en fonction de leur mobilité électrophorétique. In Berg, Tymoczko, Stryer, Biochemistry 5th ed. Fig La protéine purifiée, après migration, donne lieu à deux bandes, de mobilité relative respectives de 0.3 et 0.5. Par ailleurs, on isole la protéine native que l’on centrifuge en gradient de vélocité. Elle se stabilise à une valeur apparente de masse molaire de 145 kd En synthétisant ces données, que pouvez- vous dire de la structure quaternaire de cette protéine ? note du prof : le Dalton (= unité de masse atomique) devrait avoir comme symbole Da, et non d ; d est le symbole du jour (24 heures) : voir www1.bipm.org/utils/en/pdf/brochure- si.pdf

M=46 kDa M=28 kDa La protéine native a une masse de 145 kDa. Les deux masses après dénaturation ne sont pas multiples l'une de l'autre ==> ce sont des sous-unités différentes. 145 = à peu près 2*(46+28) Donc on peut imaginer que la protéine est un hétérotétramère : - 2 sous-unités à 46 kDa - 2 sous-unités à 28 kDa

2.1. Identification des structures II et III de l’hexokinase. En utilisant des méthodes similaires à celles décrites ci-dessus, on a montré qu’une enzyme, l’hexokinase, est un homodimère dont les chaînes sont composées de 920 acides aminés chacune. La structure d'une de ces chaînes est illustrée par la figure 2, en 3D (image c) et de façon plane en dessous : Identifiez les différentes structures secondaires présentes dans une chaîne et précisez en combien d’exemplaires chacune de ces structures est présente dans cette chaîne. Hélices α feuillets β 3 hélices α au moins 5 feuillets β feuillet β ? Les feuillets α et feuillets β ont le plus souvent été reconnus et correctement comptés. ; même si très étonnamment certains candidats ont inversés les hélices α et feuillets β.

Rappelez, par un dessin, l’organisation de chacune de ces structures (vous préciserez quel type de liaisons permet de maintenir ces structures en place). Cette schématisation a souvent été réalisée de façon peu rigoureuse voire fantaisiste; les cours de base de première année semblent bien loin à certains candidats ; les structures ont été affublées d’échelles farfelues et les liaisons peptidique et/ou hydrogène fausses. Ces deux structures sont déterminées par les liaisons hydrogène entre C=O et N-H. Hélice alpha : la chaîne polypeptidique est enroulée en une hélice droite, et stabilisée par les liaisons H entre deux tours successifs de l'hélice. Les résidus ne sont pas figurés ; ils sont à l'extérieur de l'hélice. Diamètre : 1 nm 3,6 résidus par tour d'hélice. Exemple : la kératine (poils, ongles...) feuillet beta : deux chaînes polypeptidiques sont reliées par des liaisons H. Les résidus ne sont pas figurés : ils sont à l'extérieur de la pliure du feuillet (déterminée par les C α )

2.2. Rôles de l’hexokinase L’hexokinase est capable de se lier à deux ligands : le glucose et le glucose 6 phosphate Quelle est la réaction catalysée par cette enzyme ? La réaction catalysée par cette hexokinase a rarement été écrite correctement, c'est-à-dire faisant intervenir ATP et H20. glucose + ATP--->glucose6phosphate + ADP ATP, d'accord. H2O, pas d'accord.

Rappelez dans quelle voie métabolique intervient cette enzyme (vous en détaillerez les étapes). Précisez quels effets peut avoir la liaison de cette enzyme avec l’un ou l’autre des ligands sus-mentionnés sur la voie métabolique décrite. Cette question de manière inattendue été source d’un hors sujet ; en effet beaucoup de candidats ont exposé l’ensemble du processus de la régulation de la glycémie ; alors que l’on demandait simplement de préciser que cette enzyme intervient dans la glycolyse, dont elle catalyse la première étape et d’en détailler toutes les étapes. Bien évidemment les formules n’étaient pas demandées. On attendait aussi de préciser que la liaison avec le glucose active cette enzyme (activation allostérique) alors que la liaison avec le glucose 6 phosphate : inhibe cette enzyme (inhibition allostérique). Cette enzyme intervient dans la glycolyse : glucose ---> glucose 6(P) ---> fructose 6(P) ---> fructose 1-6 di(P) --->2 glycéraldéhyde 3 (P) --->2 diphosphoglycérate --->2 phospho3glycérate --->2 phospho2glycérate --->2 phosphoénolpyruvate --->2 énolpyruvate ---> 2 pyruvate Le glucose est le substrat : sa liaison avec l'enzyme déclenche la réaction Le glucose 6 phosphate est le produit de la réaction : sa liaison avec l'enzyme inhibe la réaction, par encombrement du site actif. allostérie : ce n'est pas évident. Bien sûr, il y a deux sous-unités. Mais dans le document, rien ne dit que ces protomères aient une action l'un sur l'autre de façon allostérique.

Citez deux raisons qui font de cette réaction une étape importante de la voie métabolique citée ci-dessus. Cette question semble avoir décontenancée les candidats et malheureusement beaucoup d’entre eux ont préféré ne pas la traiter. Face à cette désertion le jury s’est contenté de deux réponses sur les trois possibles pour attribuer la totalité des points. A savoir : la mise en place d’une liaison à fort potentiel énergétique ; le passage d’une molécule neutre (glucose) à une molécule chargée (glucose 6P), ce qui piège les molécules de glucose dans la cellule et le fait qu’elle constitue une étape clé de la régulation - cette réaction nécessite de l'énergie, fournie par l'hydrolyse de l'ATP ; sans cette enzyme, l'énergie de l'ATP est inutilisable pour phosphoryler le glucose, et la réaction ne peut pas avoir lieu. - La quantité de glucose est relativement fixe dans la cellule (en équilibre avec le glucose sanguin). Grâce à cette réaction, la quantité de glucose phosphate est variable, et influera donc toute la suite de la glycolyse.

2.3. Purification d’une hexokinase de rat (G2E 2006) Une hexokinase de rat a été purifiée à partir de muscle squelettique de rat (M.J. Holroyde et I.P. Trayer, FEBS letters, 1976, 62, ). Cette purification a eu lieu en 6 étapes : 1. extraction et centrifugation 2. chromatographie 1 (DEAE cellulose) 3. chromatographie 2 (DEAE Séphadex) 4. chromatographie 3 (chromatographie d’affinité : Sépharose et dérivé de glucosamine) 5. concentration (colonne DEAE cellulose) et gel filtration (colonne de Séphadex G-200) 6. concentration Les résultats des différentes étapes de purification sont donnés : - dans le tableau 1 (étapes de purification d’une hexokinase II de rat) - sur la figure 3 (dépôt sur gel d’électrophorèse après certaines de ces étapes)

Sachant que l’activité spécifique d’une préparation enzymatique est exprimée en unités/mg de protéine, calculez les activités spécifiques à chaque étape de purification. Vous en déduirez l’étape au cours de laquelle la majeure partie de la purification a lieu Ces résultats sont-ils cohérents avec l’électrophorèse ? Le mieux était de présenter l’ensemble des résultats sous forme d’un tableau ; ceci afin de faciliter la lecture de l’examinateur et du candidat (voir question suivante). Beaucoup d’erreurs, dans les reports des valeurs, les unités et en tapant sur les touches de la calculatrice (vérifiez une fois ses calculs !). Le calcul de l’activité spécifique a parfois été écrit sans aucune explication précise. protéines totales = volume*concentration activité spécifique = activité/masse de protéines augmentation = activité spécifique nouvelle/activité spécifique ancienne Conclusion : l'étape importante est le passage de 3 à 4 : - augmentation relative de 46 fois de l'activité spécifique - l'électrophorèse ne montre plus qu'une seule bande de protéines : la protéine est bien purifiée.