Cancérogenèse chimique Introduction 1 bases moléculaires et cellulaires de la cancérogenèse chimique 1-1 le cycle cellulaire 1-2 l’ADN et les lésions de l’ADN 1-3 cancérogène génotoxique et cancérogène non génotoxique 1-4 cancérogène et procancérogène 2 les tests à court terme 2-1 mise en évidence des cancérogènes génotoxiques 2-2 mise en évidence des cancérogènes non génotoxique 2-3 pertinence des tests à court terme 3 cancérogenèse 3-1 choix de la dose, procédure 3-2 pertinence et limite conclusion

Contrôle de la prolifération Facteur de croissance ex: EGF; TGF-a Récepteur ex: erb Second messager ex: ras Transduction ex: raf Promoteur ex: myc, jun Mort apoptose multiplication prolifération

Contrôle du cycle cellulaire G1 S G2 M RB G0 + cycline D cycline E cycline A cycline B F+ P P P P signaux

Contrôle du cycle cellulaire cycline D cycline E cycline A cycline B S F+ P21 RB G0 G2 G1 P53 M

Télomères et télomérase : âge de la cellule Extrémités des chromosomes (TTAGGG)n : 5 – 15 kbases Télomérase = télomère reverse transcriptase ARN : matrice Cycle cellulaire : diminution  mort de la cellule

ADN = molécule chimique guanine thymine oxydation adduit hydrolyse

Lésions de l ’ADN Oxydation Elimination d ’une base (site AP) Dimères Fixation covalente alkylation, arylation, amination... adduits monovalent divalent (pontage) intrabrin interbrin intercalant Cassures simple brin double brin

Lésions de l ’ADN Mort nécrose/apoptose Réparation réversion REB REN mésappariement Ku/DNA PK recombinaison... Tolérance mutation génique mutation chromosomique

Exemple de système de réparation : BER et NER Excision de bases Excision de nucléotides 1 – reconnaissance de la lésion / distorsion 2 – incision, excision 3 - resynthèse exacte

Xeroderma pigmentosum : système de réparation de l’ADN déficient Peau non protégée des UV  tumeurs

Tolérance de la lésion : mutation génique Oxydation (8 oxo guanine) C A C C G T A C A C C G* T A G T G G C A T réplication G T G G A A T réplication C A C C T T A Mutation par substitution G T G G A A T Transition : A G ; T C Transversion : A T A C

Mutations géniques par décalage du cadre de lecture GG -GGGGGGG- -CCCCCCC- -GG GGG- -CC CCC- réplication Perte de deux bases Décalage du cadre de lecture (frameshift – 2)

Mutations chromosomiques - Structure des chromosomes : chromosomes circulaires fusion de morceau de chromosome … clastogène : agent physique ou chimique capable de casser les chromosomes - Nombre des chromosomes aneuploïdie : 2n +/- x chromosomes polyploïdie : n, 3n, 4n … chromosomes

Caryotype après traitement en fausses couleurs

Cellule tumorale (polyploïdie) Cellule normale

Cancérogène génotoxique Composé (molécule mère ou métabolite) dont l’activité biologique primaire est l’altération de l’information codée par l’ADN. Mutation qui se traduit par : Activation d’oncogènes Inactivation d’anti-oncogènes Cancérogène non génotoxique (épigénétique) Non organe spécifique : interagit avec les protéines de proliférations des cellules (en activant les protéines codées par des oncogènes ou en inhibant les protéines codées par des anti-oncogènes). responsable d’une inflammation : facteurs de prolifération et production de radicaux libres (ex : ROS = reactive oxygen species). Organe spécifique : hormones : œstrogène et cancer du sein, testostérone et cancer de la prostate. TSH et thyroïdes.

Génotoxique / non génotoxique 1970 - 1978 : cancérogènes = mutagènes 1978 - 1985 : il y a quelques exceptions 1985 - 1990 : exceptions de plus en plus nombreuse autre mécanisme ? 1994 : génotoxique / non génotoxique Détection, évaluation ??

Composé progénotoxique : bioactivation indispensable N d ’une guanine

Cancérogenèse chimique : plusieurs étapes Progression perte p53 Carcinome squameux Cellules épithéliales Cellules initiées Papillome bénin Progression E-cadherine TGF-b Initiation Mutation H-ras Promotion Sur-expression cycline D1 Carcinome spino-cellulaire 1 - Initiation (irréversible) 2 - Promotion (réversible) 3 - Progression (irréversible) métastases

Plusieurs étapes et plusieurs clones de cellules : mutation mutation +/- facteurs de croissance Facteurs de croissance probabilité : facteurs risques irréversible  multiplication

Bilan première partie : - Cancérigènes génotoxiques : lésions tolérées – mutation – oncogène activé / anti-oncogène inactivé Cancérigènes non génotoxiques (épigénétiques) : stimule la prolifération, inhibe l’apoptose, inhibe communication entre les cellules - Cancérogenèse : molécule mère et/ou métabolites - Cancérogenèse : plusieurs étapes, phénomènes irréversibles et réversibles

2 les tests à court terme 2-1 mise en évidence des cancérogènes génotoxiques 2-2 mise en évidence des cancérogènes non génotoxique 2-3 pertinence des tests à court terme

Marqueurs à court terme de génotoxicité Mort apoptose (cassure de l’ADN) nécrose Lésions oxydation perte de bases dimère fixation intercalant cassures Réparation réversion REB REN mésappariement …. Mutations génique chromosomique

Essai comète : Faux positifs : apoptose

Micronoyaux: fémur 1 000 cellules (bruit de fond : 0,5%) 1 à 2 cycles pour réponse optimale Faux positifs : apoptose

Synthèse non programmée ADN (UDS) Réparation par excision de nucléotides 1 – culture de cellules / produit à tester 2 – éventuellement lésions de l’ADN réparées par NER 3 – étape resynthèse en présence de nucléotides radio-marqués Autoradiographie sur cellules : taches / radioactivité

UDS : Réplication Réparation ADN

Étude des composés non génotoxique :. test de prolifération Étude des composés non génotoxique : test de prolifération test de phosphorylation Facteur de croissance ex: EGF; TGF-a Récepteur Second messager ex: ras Transduction ex: raf Promoteur ex: myc, jun multiplication prolifération

Produit à tester Prolifération de péroxysomes Organites cytoplasmiques H2O2 oxydase /H2O2 catalase enzymes oxydation Produit à tester

Marqueurs d ’une génotoxicité Batterie: spécificité Pertinence: modèle de la cancérogenèse chimique relation marqueur / cancer ??? donc : facteur risque (probabilité) in vitro automatisable extrapolation in vivo biodisponibilité élimination (t1/2) dose bioactivation (système biaisé)

3 cancérogenèse 3-1 choix de la dose, procédure 3-2 pertinence et limite

Essai de cancérogenèse sur 2 ans Principe : Produit à tester / animal / longue durée Marqueur : tumeur Problème : Bruit de fond important

Fréquence des tumeurs spontanées Rongeurs habituellement utilisés en toxicologie après 2 ans, protégés des cancérogènes:

Exemple : détermination de la DT01; chez des souris: 24 000 animaux / groupe Compromis: MTD 50 animaux / groupe

Extrapolation des résultats des études de cancérogenèse

Cancérogènes non génotoxiques : tumeurs Boite noire

Bilan : 24 organes avec des tumeurs Glycidol : Bilan : 24 organes avec des tumeurs Rats mâles Rats femelles Souris mâles souris femelles Limonène : Bilan : 1 site (reins) dans 1 groupe Rats mâles Rats femelles Souris mâles souris femelles

Cytotoxicité du composé et tumeurs (MTD, 2 ans !) a2µ-globuline : protéine synthétisé chez le rat mâle (hépatique) filtrée / glomurule partiellement réabsorbée (endocytose) La fraction réabsorbée se trouve dans les lysosomes où la protéine est hydrolysée d-limonène se fixe sur la globuline qui n’est plus hydrolysée, elle s’accumule et entraîne la libération des enzymes des lysosomes dans le cytoplasme  nécrose des cellules, inflammation chronique et développement de tumeurs. Saccharine : formation de microcristaux dans la vessie, lésions de l’épithélium, inflammation chronique, prolifération cellulaire, tumeur

+ Pertinence de l’information Cancérogenèse sur 2 ans Caractérisation du mécanisme de la toxicité Pertinence de l’information

Conclusion :

Estimation du risque cancérogène Cancérogène génotoxique irréversible 1 cellule 1 clone (1 tumeur) Aléatoire - probabilité bilan: pas de seuil pas de dose / effet dose / probabilité Mutation transmise cellules filles Cancérogène non génotoxique réversible dépend de l ’environnement (ex: inflammation, alimentation riche en AG poly-insaturés…) bilan: dose/réponse et seuil

Activité du TPA (phorbol ester) Nombre de papillomes par souris 15 12 9 6 3 Concentration M 10-9 10-8 10-7 10-6

Estimation du risque cancérogène Agent à tester (100 000 / an) structure ? mutation in vitro (Ames) ? Abandon du composé cytogénétique ? micronoyau in vivo ? mutation in vivo (animaux transgéniques) ? en fonction des résultats de toxicologie générale (sensibilité d ’organe) Essais non génotoxique prolifération (foie, estomac, peau, poumon…) peroxysomes hépatiques thyroïdes induction de P450 inflammation ... Caractérisation, DSE, … Cancérogenèse à long terme (2 ans)

Classification des substances (Europe) Cancérogènes catégorie 1 : substances que l’on sait être cancérogènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour établir l’existence d’une relation de cause à effet entre l’exposition de l’homme à de telles substances et l’apparition d’un cancer. - catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances cancérogènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour justifier une forte présomption que l’exposition de l’homme à de telles substances peut provoquer un cancer. Cette présomption est généralement fondée sur des études appropriées à long terme sur l’animal ou d’autres informations appropriées. - catégorie 3 : substances préoccupantes pour l’homme en raison d’effet cancérogènes possibles mais pour lesquelles les informations disponibles ne permettent pas une évaluation satisfaisante (preuves insuffisantes). Il existe des informations issues d’études adéquates sur les animaux mais elles sont insuffisantes pour classer la substance dans la catégorie 2.

Classification des substances (Europe) Mutagènes catégorie 1 : substances que l’on sait être mutagènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour établir l’existence d’une relation de cause à effet entre l’exposition de l’homme à de telles substances et des défauts génétiques héréditaires. - catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances mutagènes pour l’homme. On dispose de suffisamment d’éléments pour justifier une forte présomption que l’exposition de l’homme à de telles substances peut provoquer des défauts génétiques héréditaires. Cette présomption est généralement fondée sur des études appropriées sur l’animal ou d’autres informations appropriées. - catégorie 3 : substances préoccupantes pour l’homme en raison d’effet mutagènes possibles. Des études appropriées de mutagénicité ont fournies des éléments, mais ils sont insuffisants pour classer la substance dans la catégorie 2.

Etiquetage - Europe classement Symbole Phrases de risque Seuil (1) Cancérogène catégorie 1 T (toxique) R 45 ou R 49  0,1% Cancérogène catégorie 2 Cancérogène catégorie 3 Xn (nocif) R 40  1 % Mutagène catégorie 1 R 46 R 68 R 40 : effet cancérogène suspecté – preuves insuffisantes R 45 : peut causer le cancer R 49 : peut causer le cancer par inhalation R 46 : peut causer des altérations génétiques héréditaires R 68 : possibilité d’effets irréversibles (1) : préparations autres que gazeuses, (2) : préparations gazeuses

Classification du centre internationale de recherche sur le cancer (CIRC/IARC) 5 catégories: groupe 1 : l’agent (ou le mélange) est cancérogène pour l’homme groupe 2A : l’agent (ou le mélange) est probablement cancérogène pour l’homme groupe 2B : l’agent (ou le mélange) est un cancérogène possible pour l’homme groupe 3 : l’agent (ou le mélange) ne peut être classé du point de vue de sa cancérogénicité pour l’homme groupe 4 : l’agent (ou le mélange) est probablement non cancérogène pour l’homme