Histologie Faculté de médecine Saint-Antoine NM 08/2004 Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Histologie Faculté de médecine Saint-Antoine NM 08/2004

Principes généraux échantillonnage du prélèvement, fixation, deshydratation, inclusion (paraffine, résine), coupe, colorations, observation.

I- Les coupes histologiques 3 à 5 µm d’épaisseur, quelques centimètres de largeur et longueur, nombreuses colorations possibles, montées entre lame et lamelle, grandissement de 10 à 1000 fois (environ).

Techniques de fixation Immersion dans le fixateur la technique la plus utilisée (routine). Perfusion intravasculaire ou intraluminale très bonne fixation, délicate à mettre en place, pour la recherche.

Fixation Elle doit : préserver les structures tissulaires et cellulaires, éviter les artefacts (gonflements, rétractions), être rapide, permettre des colorations topographiques, permettre l’immunohistologie, être peu ou pas toxique.

Il n’y a pas de fixateur idéal Il faut le choisir en fonction de ses avantages et inconvénients. Parmi des centaines disponibles !

le formol seul (formaldéhyde dilué) dans l’eau courante, ou tamponné bon marché, incolore, permet la fixation de grosses pièces, permet l’immunohistologie MAIS allergisant, carcinogène.

Les fixateurs contenant du formol (1) AFA (Acide acétique Formol Alcool) très rapide (risques de surfixation), permet les marquages immunohistologiques. MAIS peu pénétrant. idéal pour les biopsies

Les fixateurs contenant du formol (2) Bouin (Acide acétique Formol Acide picrique) rapide, pénétrant, légères rétractions tissulaires, très belles colorations topographiques, MAIS ne permet que difficilement l’immunohistologie, coloré : tache ! (et ne part qu’avec l’épiderme). Idéal pour voir des gg. lymphatiques dans le tissu adipeux

Quel que soit le fixateur, le prélèvement doit être échantillonné et la taille des échantillons adaptée à celle de la cassette d’inclusion.

Deshydratation L’eau tissulaire est remplacée par de la paraffine. Mais ces milieux ne sont pas miscibles entre eux. On procède donc par étapes en remplaçant : l’eau par un alcool, l’alcool par un solvant organique, le solvant par la paraffine

Deshydration et Inclusion : l’automate les bacs contiennent des alcools (5 bains), des solvants organiques (5 bains), de la paraffine chaude (3 bains). Remarque : machine historique ! Elle a 40 ans et fonctionne toujours !

Confection du bloc : Enrobage

Un moule est rempli de paraffine liquide

Le prélèvement est mis en place et le bloc mis à refroidir

Démoulage, après refroidissement

Mise en place du bloc sur le microtome

Confection des coupes : le ruban

Etalement sur lame

Séchage avant coloration

Les colorations sont infinies Les colorations sont infinies. Ne vous fiez pas à la couleur pour « reconnaître » une structure !

Observations, photographies.

Résultat surprise Poumon de chien

Et n’oubliez pas …. De remettre vos lames dans les boîtes, vous nous aiderez !

Microscopie électronique Quelques millimètres de largeur et longueur, 60 à 100 nanomètres d’épaisseur, coupe déposée sur une grille métallique, rares colorations possibles, grandissement de 1000 à 100.000 fois.

Les blocs environ 2 mm3 de tissu, fixation immédiate glutaraldéhyde / tétroxyde d’osmium, inclusion en résine, imprégnation par métaux lourds (plomb).

Coupe (dégrossissage au couteau de verre)

Coupe ultra-fine (couteau diamant)

Les coupes sur grille métallique

Le (vénérable) microscope électronique de la fac’

Mise en place de la grille

Observation

Mise au point, observation

En microscopie optique, les plus forts grandissements sont : X 400 X 1 000

En microscopie électronique, le plus fort grossissement est x 100 000. Les plus couramment utilisés sont entre x 3 500 et x 50 000 X 40 000