Caractérisation structurale d ’un régulateur transcriptionnel du « Quorum Sensing » chez Brucella abortus

Le « Quorum Sensing » des bactéries Gram- « Le ‘Quorum Sensing’ est un phénomène par lequel l’accumulation d’une phéromone de faible poids moléculaire permet à la cellule individuelle de percevoir quand l’unité de population minimale ou ‘quorum’ de bactéries est atteint, pour initier une réponse concertée de l’ensemble de la population » (Fuqua 1994) Production de lumière chez la bactérie marine Vibrio fischeri Haute densité cellulaire : Autoinduction de la luminescence

Lumière + Quorum Sensing chez Vibrio fischeri Lux I : Lux R : La synthétase de phéromone luxR luxI luxCDABE + OHHL : La phéromone ou l ’autoinducteur Lumière Lux R : Le régulateur transcriptionnel activé par OHHL OHHL

Caractéristiques structurales des régulateurs de la famille LuxR actifs sous forme d’un dimère association à la membrane organisés en deux domaines structuraux problèmes de purification structures 3D N C Liaison à la phéromone (HSL) Liaison à l ’ADN via un motif Hélice-coude-hélice (HTH)

Brucella abortus, notre organisme d ’intérêt Coccobacille Gram-négatif Pathogène intracellulaire Provoque une zoonose qui atteint quelquefois l ’homme Un système de « Quorum Sensing » a récemment été identifié chez cette bactérie et le régulateur transcriptionnel correspondant a été nommé BabR. C’est un homologue de LuxR (25% d ’identité selon l ’alignement donné par ALIGN).

OBJECTIF Caractériser structuralement le régulateur transcriptionnel BabR de Brucella abortus à l’aide d’outils bioinformatiques . Les différentes étapes suivies: .Obtenir la topologie de BabR et de ses homologues les plus proches .Obtenir un modèle 3D du domaine C-terminal de BabR pour pouvoir analyser plus en détail le motif HTH. .Obtenir le plus d’informations structurales possibles sur le domaine N-terminal de BabR

Obtention de la topologie de BabR et de ses homologues 1 Obtention de la topologie de BabR et de ses homologues

Recherche de séquences similaires (BLAST) BabR Séquence complète Recherche de séquences similaires (BLAST) Sélection des homologues les plus similaires ( E-value < à 0,01) > à 30% d ’identité* avec BabR > à 30% d ’identité* avec BabR + LuxR (prot.réf.) Toutes les séquences Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) Alignement multiple (Match-Box,ClustalW) * pourcentage d ’identité déterminé par ALIGN

CONSENSUS des méthodes de prédictions de structures secondaires > à 30% d ’identité avec BabR + LuxR (prot.réf.) Méthodes de prédictions de structures secondaires pour déterminer la topologie de BabR et des différents homologues ( PHD, PSIpred, PREDATOR, JPRED,PROF) CONSENSUS des méthodes de prédictions de structures secondaires

Méthode utilisée pour réaliser le consensus Score PHD Score PSIPRED

Consensus des différentes méthodes pour les 11 séquences (BabR et ses homologues ( en moyenne 240 a.a.)) N BabR HOMOL. LuxR Dom. C-term Dom. N-term C HELICE a BRIN b

2 Obtention du modèle 3D du domaine C-terminal de BabR et analyse plus détaillée du HTH

Domaine C-Terminal de BabR Recherche d ’homologues dans la banque de structures PDB 1 résultat significatif: NarL (E-value=0,077) Reconnaissance de « Fold » (3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) 1 résultat significatif (4 méthodes sur 5): NarL

Détermination d’un consensus des alignements BabR-NarL fournis par différentes méthodes : Alignements séquence-séquence Alignements séquence-structure ALIGNEMENT SEQUENCE-STRUCTURE OPTIMAL : 61 derniers résidus de BabR alignés de façon certaine avec NarL (dom. Cterm) Les autres résidus: lien flexible et donc alignement incertain

Alignment BabR Cterm.-NarL final

Le modèle du domaine C-terminal de BabR

Caractérisation plus détaillée du HTH 1. Analyse de 4 complexes ADN-protéine : -répresseur  -répresseur LexA -répresseur P22 -répresseur Cro Visualisation des ponts H entre le HTH et les bases nucléotidiques de chaque complexe Détermination des résidus de chaque HTH interagissant de manière spécifique avec l ’ADN

COMPLEXE HTH-ADN (1QAA)

Détermination des résidus interagissant de manière spécifique avec l ’ADN

2. Extrapolation au domaine HTH de BabR (d ’après l ’analyse HTH-ADN et l ’alignement avec LuxR) Asn 215 His 212 Thr 208 Ser 205

Caractérisation structurale du domaine N-terminal de BabR 3 Caractérisation structurale du domaine N-terminal de BabR

Domaine N-Terminal de BabR Recherche de séquences similaires (BLAST): Aucun résultat significatif Reconnaissance de « Fold » (3DPSSM, THREADER 2.5, TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) Pas de structure mais 1 topologie donnée par plusieurs méthodes : Le « Rossman Fold »

Modèle topologique d ’une protéine de type « Rossman fold »

Structure 3D d ’une protéine adoptant une topologie de « Rossman fold »

Modèle topologique du domaine N-term. de BabR L ’alignement BabR-LuxR permet de définir sur la topologie les résidus importants dans la liaison à l ’HSL et donc de localiser la région de liaison.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES But d’un modèle = générer des hypothèses testables au laboratoire Nous avons généré des hypothèses pour le domaine N-terminal et pour le domaine C-terminal. Nous avons pu caractériser structuralement une protéine de la famille LuxR. Des résidus ont été prédits comme importants, soit dans la liaison à l’ ADN soit à la phéromone; ils pourront donc être testés par des expériences de mutagenèse dirigée.