REDONDANCE FONCTIONNELLE Pourquoi des gènes dupliqués chez les Angiospermes ?

Comment expliquer l ’observation de mutants “knock-out” ne présentant pas de phénotype ou seulement un phénotype « léger » ?

Plan I - Mécanismes responsables des duplications II - Rôle des gènes dupliqués dans la « robustesse » envers les mutations nulles (exemple de la levure) III - Quelques exemples choisis de redondance

Mécanismes responsables des duplications

Short- range duplication cluster

MAP2K

Polyploïdie - La plupart des Angiospermes et 5% des Gymnospermes sont polyploïdes. En général doublement somatique du génome ou non réduction des cellules mères des spores - Le nombre chromosomique le plus élevé des Angiospermes serait celui de Sedum suaveolens (2n = 640), mais 2n = 1260 chez la Fougère Ophioglossum pycnostichum - La polyploïdisation se poursuit dans le genre Arabidopsis, avec A. suecica (2n=26) qui est un allo-tétraploïde entre A. thaliana et l ’ancêtre d’A. arenosa (2n = 4x = 32) - Pour les espèces cultivées : 2n = 42 chez le blé tendre, 20 chez le maïs, 52 chez le coton, 48 chez la pomme de terre, 38 chez la vigne

Les origines d’Arabidopsis 1) Une duplication très ancienne (origine des Angiospermes), une ancienne (100 millions d’années) survenue dans l’ancêtre des Eudicotylédones 2) Une duplication « récente » (24-40 M d’années) du génome d’une Brassicaceae ancestrale : - passage de 2n = 2x = 8 à 2n = 4x = 16 chromosomes - perte de 70 % des gènes dupliqués 3) Remaniements chromosomiques (une soixantaine) 4) Fusions centriques (il y a 5 M d’années) réduisant le nombre de chromosomes de n = 8 à n = 5 5) Quelques duplications segmentaires (rDNA, bloc RAQ)

Un maximum des éliminations de gènes se produisent tôt Blanc et al. 2003 (Genome Research) - 71% du génome d’A. thaliana dans 45 segments dupliqués depuis 24 à 40 millions d’années (âge des Brassicaceae), avec 28 % de gènes dupliqués, soit # 5800 gènes dupliqués. - 26 % du génome d’ A. thaliana dans 63 segments dupliqués depuis près de 100 millions d’années (âge des Rosidae), avec 13,5 % de gènes dupliqués, soit # 1000 gènes dupliqués. (Maere et al. 2005 proposent 771, 2765, 3947 gènes conservés) En 100 Ma 86,5 % des gènes sont éliminés, et en 24-40 Ma 72% des gènes sont éliminés Un maximum des éliminations de gènes se produisent tôt

Chez les Angiospermes, l’accumulation de paralogues, résulte de divers mécanismes allant d’évènements « locaux » (duplication en tandem) « dispersifs » (duplication à courte distance, insertion d ’un rétrotranscrit, duplication segmentaire) jusqu’à des évènements « de grande ampleur » (duplication chromosomique ou génomique) Une vue simpliste du résultat de ces mécanismes est la présence de deux copies là où une seule suffisait. Quel est donc l’intérêt de la seconde copie ?

Rôle des gènes dupliqués dans la « robustesse » envers les mutations nulles (exemple de la levure)

La mutation KO d’un gène de levure en copie unique possède % 64,3 1147 gènes dupliqués 1275 singletons 50 Gu et al., Nature 21 janvier 2003 39,5 29 21,5 11,5 11,6 12,4 10,5 effet du knock-out effet faible effet modéré effet fort létal 50 % singletons - 76 % dupliqués 50 % singletons - 24 % dupliqués La mutation KO d’un gène de levure en copie unique possède 2 fois plus de chances de présenter un phénotype marqué.

Relation entre la divergence des protéines (Ka) et l’effet des délétions sur la valeur adaptative séquences proches séquences divergentes Ka Effet effet faible effet fort 0 - 0,1 0,94 0,06 0,4 - 0,5 0,72 0,28 > 0,7 0,63 0,37 La fréquence décroît avec l’augmentation de Ka R= -0,95 (P < 0,001) La fréquence croît avec l’augmentation de Ka R= 0,94 (P < 0,001) Il existe une forte corrélation entre la fréquence de complémentation fonctionnelle et la similarité de séquence des deux gènes dupliqués Ka = distance (non synonyme) avec le gène le plus proche

Nombre de paires de gènes dont la délétion affecte fortement le phénotype Niveau d’expression FORT FAIBLE total Nb total 247 146 393 72 a 26 b 98 50 a 12 b 62 125 108 233 effet différent un létal effet similaire a, b : dans une colonne, les nombres suivis d’une lettre différente indiquent une différence significative au seuil 0,001 Plus le gène est exprimé, plus sa délétion affecte la complémentation (dans 72 des 98 paires de gènes à effet différent, le plus fort effet sur la complémentation provient de la délétion du gène le plus exprimé) NB: chez un allotétraploïde, il n’est pas étonnant que les 2 gènes dupliqués ne s’expriment pas au même niveau, chacun provenant d’une espèce différente.

Chez la levure environ 60 % des gènes compensent les mutations nulles du fait de leur duplication, mais : - des conditions dans lesquelles les singletons ne sont plus compensés peuvent exister - tous les paralogues n’ont pas nécessairement été détectés Chez A. thaliana, la fréquence des gènes dupliqués est très élevée : - Il existe 35% de séquences uniques chez A. thaliana contre 55% chez C. elegans, 72% chez D. melanogaster et 71% chez S. cerevisiae - Les familles de plus de 5 membres constituent 8% des gènes chez S. cerevisiae, 12% chez D. melanogaster, 24% chez C. elegans et plus de 37% chez A. thaliana Ceci justifie l’importance particulière des gènes dupliqués chez les plantes supérieures, et suggère que la redondance fonctionnelle y soit particulièrement présente.

Divers évènements surviennent rapidement après le doublement du nombre de chromosomes (donc de gènes) : - extinction de gènes : la copie est éteinte par mutation ou par un mécanisme épigénétique. Chez le blé des gènes du groupe A, codant pour des protéines de l’albumen, sont rendus silencieux. L’accumulation de mutations peut produire un pseudogène ou un fantôme. - délétion de gènes - remaniements chromosomiques - subfonctionalisation, fonctions recouvrantes, conservation de la fonction ancestrale, néofonctionalisation En termes d’interactions entre gènes, il est évident que de nouvelles interactions entre les génomes vont exister (dominance, épistasie). Qui plus est, on a pu noter l’intervention de conversion, de recombinaison inter loci, d’évolution concertée, d’échange chromosomique inter-génomique, d’invasion génomique, de rééquilibrage nucléo-cytoplasmique.

La présence d’un second gène offre quelques avantages : maintien des 2 gènes quand l’accroissement du niveau de transcripts est avantageuse. Les deux cas existent : niveau d’expression corrélé positivement avec le nombre de copies, ou maintenu constant malgré le grand nombre de copies (« dosage-compensation effect ») la redondance donne un léger avantage sélectif (à certains moments, dans certaines conditions environnementales,…) - les gènes dupliqués peuvent être maintenus car pléïotropes, ou parce que cela présente un avantage sélectif (protéines multifonctionnelles, ou éléments de multifonctionalité). Plus généralement, les espèces polyploïdes présentent : - une très large gamme de gamètes (répartition centromères) - un fort niveau de variation génétique (origines multiples) - une forte hétérozygotie (parents différents) - une faible dépression inbred (présence de plusieurs génomes)

Quelques exemples choisis de redondance

Un exemple simple de redondance : les facteurs de transcription TGA2, 5 et 6 TGA6 (At3g12250) TGA2 (At5g06950) TGA5 (At5g06960) bloc dupliqué récent duplication en tandem - les protéines TGA2, TGA5 et TGA6 sont partenaires de NPR1, Non- expressor of Pathogenesis-Related (PR) - le mutant npr1-1 et le triple mutant tga6-1 tga2-1 tga5-1, sont sensibles aux fortes concentrations en acide salicylique (SA) - induction de l’expression des gènes PR et résistance aux pathogènes des simples mutants nuls tga6-1, tga2-1 et tga5-1, et du double mutant tga2-1 tga5-1. Pas d’induction chez le triple mutant tga6-1 tga2-1 tga5-1 dont la SAR (systemic acquired resistance) est abolie.

Un exemple de redondance maintenue très longtemps, le facteur de transcription LEAFY (LFY) - développement floral - 2 paralogues LFYm et LFYf chez les conifères - 1 orthologue de LFYm chez les Angiospermes (et un pseudogène chez Nymphea) théorie « mostly male » - LFYm et LFYf complémentent le mutant nul lfy d’A. thaliana Angiospermes Conifères Gnétales Gymnospermes monophylétiques Cycadales Ginkgo L’ancêtre commun le plus récent des Angiospermes et des Gymnospermes aurait au moins 300 millions d’années. NB : la fleur bisexuée n’a pas plus de 130 millions d’années.

Perception de l’éthylène Deux familles de récepteurs : . I avec des résidus essentiels pour l’activité his kinase : ETR1, ERS1 . II sans ces résidus : ETR2, EIN4, ERS2 Pas de réponse à l’éthylène chez les simples mutants ponctuels etr1, etr2, ein4, ers1 et ers2. Ce sont des mutants dominants, insensibles à l’éthylène. - On a recherché des suppresseurs de ces mutants, présentant un phénotype sauvage, que ce soit en présence d’air (allongement normal) ou d’éthylène (triple réponse : racine et hypocotyle courts et larges, courbure apicale exagérée) : etr1-5 (à 8), etr2-3 (et 4), ein4-4 (à 12), ers2-3, ers1-2. Mutants knock-out récessifs, réponse à l’éthylène, donc phénotype sauvage. Le knock-out de ces récepteurs n’entraîne pas une absence de réponse à l’éthylène, mais au contraire la triple réponse. Il en va de même pour les double et triple mutants comme etr1-6 ein4-4, etr1-6 etr2-3, etr1-6 etr2-3 ein4-4.

et nain) retrouve la triple réponse en présence d ’éthylène. - Seul le quadruple mutant etr1-6 etr2-3 ein4-4 ers2-3 (par ailleurs stérile et nain) retrouve la triple réponse en présence d ’éthylène. ETR1 ERS1 ETR2 EIN4 ERS2 C2H4 CTR1 réponse There is a degree of functional redundancy between receptor isoforms Hua and Meyerowitz (1998). Le double mutant etr1-ers1, le seul qui présente une très forte réponse phénotypique (rosette miniature, fertilité réduite, morphologie florale), n’est pas totalement compensé par la surexpression des récepteurs du groupe II. La famille I présente un rôle différent (interaction avec le domaine régulateur de CTR1).

Un exemple de fonctions recouvrantes Glabra 1 (GL1) et Werewolfe (WER) sont des facteurs de transcription de type MYB, et ne correspondent pas à des gènes dupliqués Épiderme racinaire TTG Épiderme foliaire TTG WD40 bHLH GL3 GL1 WER WER, exprimé dans les cellules épidermiques racinaires, réprime la production de poils racinaires dans certaines files de cellules GL1, exprimé dans les cellules épidermiques foliaires, permet la production de trichomes Protéine à homéodomaine GL2 GL2 Pas de poils racinaires Trichomes WER et GL1 régulent GL2. La protéine Transparent Testa Glabra (TTG) accroît la production de trichomes à partir de l’épiderme foliaire, et inhibe la formation de poils racinaires à partir de l’épiderme racinaire.

Les constructions séquence régulatrice WER-protéine GL1 et celle séquence régulatrice GL1-protéine WER permettent, respectivement dans les mutants wer et gl1, de restaurer un phénotype sauvage (i.e. trichomes, pas de poils racinaires). Les protéines GL1 et WER sont interchangeables, mais cette équivalence ne s’étend pas aux autres MYB-R2R3. Dans les deux cas les profils d’expression sont normaux. Ces résultats suggèrent que les différences d’expression observées entre WER et GL1 résultent de leurs séquences régulatrices. A partir d’un gène MYB ancestral, les ancêtres des gènes WER et GL1 ont séparé leurs profils d’expression, de telle manière que chaque gène fils ne retienne qu’une partie de la fonction ancestrale : - spécification « épiderme foliaire » pour p-GL1 - spécification « épiderme racinaire » pour p-WER

Un exemple complexe de redondance AGL1 = SHP1 100 duplication récente 24-40 Ma AGL5 = SHP2 duplication ancienne 100 Ma Agamous 99 AGL11 = STK gènes de gymnospermes AGL12, 7, 14 AGL1, AGL5, Agamous et AGL11 appartiennent au même groupe monophylétique de gènes homéotiques (MADS box). Ce groupe a divergé depuis la séparation des ancêtres des Angiospermes et des Gymnospermes, il y a environ 300 Millions d’années

STK Seedstick AG Agamous SHP1, 2 Shaterproof mutant ag, ni Redondance AG-SHP pour le développement des carpelles, et redondance AG-STK-SHP pour l’identité « ovule » SHP1, 2 Shaterproof AG Agamous Détermination florale Identité des carpelles Déhiscence du fruit mutant ag, ni carpelles, ni étamines, fonction C du modèle ABC mutants shp1 et shp2, pas de phénotype Identité des étamines Identité des ovules Identité du funicule AG, SHPs, STK qui dérivent d’un même gène ancestral (fonctions C et D), ont conservé des fonctions redondantes,tout en développant des fonctions nouvelles spécifiques Abscission de la graine mutant stk : les graines ne se détachent pas (fonction D modèle ABCD) STK Seedstick

du génome, les conséquences fonctionnelles de la duplication sont Outre l’accroissement de complexité dans l’organisation et la structure du génome, les conséquences fonctionnelles de la duplication sont diverses : - redondance fonctionnelle totale - redondance partielle, fonctions recouvrantes Dans le cas de la levure (S. cerevisiae), on observe l’existence d’un recouvrement fonctionnel dans certains cas, mais la conservation de gènes dupliqués a également eu comme conséquence le fait qu’une des 2 copies se spécialise dans une nouvelle fonction. La présence d’une seconde copie du gène confère une résistance accrue envers les mutations nulles (i.e. une amélioration de la valeur adaptative).

USE IT OR LOOSE

Chez la levure donc, 5000 gènes dupliqués font 10000, mais 90% des dupliqués perdus font 5500 gènes actuels. En fait 457 gènes dupliqués : - La plupart de ces gènes dupliqués (321 paires) conservent la même fonction, et divergent peu, et 60 paires proviennent de conversion. - 76 paires montrent une divergence forte des séquences protéiques (accelerated protein evolution) par comparaison avec K. waltii). Dans 95% des cas, une seule des 2 séquences évolue plus vite : 13 kinases, 8 protéines régulatrices……La protéine la plus divergente possède la nouvelle fonction,parfois très éloignée de l’ancienne : ainsi Sir3 (silencing des télomères,…) dérive de la fonction ancestrale de Orc1 (large sous unité du complexe de l’origine de réplication). La délétion du paralogue ancien est létale dans 18% des cas, jamais létale pour le paralogue dérivé. 32 séquences montrent une évolution accélérée des séquences nucléotidiques.

Chez Arabidopsis, 7% des gènes dupliqués sont significativement plus souvent dupliqués que la moyenne (kinases) ou moins souvent dupliqués (DNA repair) : - Ainsi, au lieu de 72% des gènes dupliqués récemment (24-40 Ma) éliminés, nous observons pour l’ensemble des kinases 33,3 % de gènes éliminés (17.9% pour les kinases qui ne sont ni de type raf ni de type récepteur kinase, 10% pour les raf, 21,3% pour les RLKs). - Les gènes dupliqués (polyploïdisation ou tandem) ont en moyenne : Une plus longue séquence, 2) plus de domaines protéïques, 3) plus de régions cis-régulatrices, que les singletons. Les gènes complexes seraient plus souvent dupliqués que les autres, car plus « faciles » à subfonctionaliser. - La polyploïdisation et plus généralement la duplication de gènes, peut-elle conduire à la duplication d’une voie de signalisation entière, à la duplication d’un complexe ou d’un module de signalisation ? La réponse est très probablement OUI.