Chapitre 2 titre La matière vivante 1ère partie

plan 1. Méthodes d’étude. 1.1. Microscope photonique. 1.2. Microscope électronique. 1.3. Les méthodes de fractionnement. plan 1.3.1. Sédimentation / précipitation. 1.3.2. Centrifugation. 1.3.3. Chromatographie. 1.3.4. Electrophorèse. 1.4. Les traceurs isotopiques. 1.4.1. Autoradiographie. 1.4.2. Fractionnement cellulaire.

Quelles que soient les variations de forme et de physique, nous sommes tous fait de matière vivante. intro Si l’on établit un inventaire des constituants du corps humain, on trouverait organes, cellules, molécules, ions,... Mais où se trouverait l’essence de la vie ? Ce qui anime la matière est impalpable, inabordable. Son origine est-elle intrinsèque ou extrinsèque ? C’est un sujet de discorde entre matérialistes et croyants. L’homme de Vitrule de Léonard de Vinci. PLAN 3

La lumière traverse la préparation 1. Méthodes d’étude. 1.1. Microscope photonique. 1.1.1 1.1.1. Microscope à fond clair. Principe La lumière traverse la préparation Objet sombre sur fond clair Préparation fine Résolution limitée: 0,25 µm PLAN 4

La lumière est réfléchie 1. Méthodes d’étude. 1.1. Microscope photonique. 1.1.2 1.1.2. Microscope à fond noir. Principe La lumière est réfléchie par l’objet. Préparation plus épaisse PLAN 5 Résolution limitée: 0,25 µm

1.1.2 1. Méthodes d’étude. 1.1. Microscope photonique. Cyclops 1.1. Microscope photonique. 1.1.2 Nitzschia 1.1.2. Microscope à fond noir. Puce d’eau Bulles d’eau Cellules d’oignon PLAN 6

1.1.3 1. Méthodes d’étude. 1.1. Microscope photonique. Pour l’échelle, c’est n’importe quoi ! 1.1. Microscope photonique. 1.1.3 1.1.3. Microscope à fluorescence. électron Principe On utilise des UV excitation noyau atomique Le plus souvent ce sont des AC pour un marquage spécifique. On fixe des fluorochromes sur la préparation. Les fluorochromes sont excités (c’est une histoire d’électron). Ils émettent de la lumière. relaxation PLAN 7

1.1.3 1. Méthodes d’étude. 1.1. Microscope photonique. 1.1.3. Microscope à fluorescence. PLAN 8

1.2.1 1. Méthodes d’étude. 1.2. Microscope électronique. 1.2.1. Microscope classique. Principe On utilise un écran fluorescent ou un capteur d’électrons relié à un ordinateur Résolution importante: 1 nm Préparation de l’échantillon minutieuse. Préparation ultra-fine On utilise un flux d’électrons qui traverse la préparation. Empreinte au métaux lourds PLAN 9

1.2.1 1. Méthodes d’étude. 1.2. Microscope électronique. 1.2.1. Microscope classique. Préparation de l’échantillon minutieuse. Préparation ultra-fine Empreinte au métaux lourds PLAN 10

1.2.1 1. Méthodes d’étude. 1.2. Microscope électronique. 1.2.1. Microscope classique. PLAN 11

1.2.2 1. Méthodes d’étude. 1.2. Microscope électronique. La différence réside dans la préparation de l’échantillon. 1.2.2 1.2.2. Microscope à balayage. Principe Pas de différence fondamentale au niveau du système. C’est une technique mise au point afin de visualiser les reliefs de la préparation. PLAN 12

1.2.2 1. Méthodes d’étude. 1.2. Microscope électronique. Cryodécapage 1.2. Microscope électronique. La différence réside dans la préparation de l’échantillon. 1.2.2 1.2.2. Microscope à balayage. Ombrage On projette un film de carbone selon un angle incident. On créé artificiellement un effet d’ombre. Technique dite de la « forêt noire » On tranche la génoise dans le sens de l’épaisseur. PLAN 13

Ils sont bien plus jolis en relief. 1. Méthodes d’étude. 1.2. Microscope électronique. Papillon 1.2.2 1.2.2. Microscope à balayage. Attention: le cliché est coloré par ordinateur. Les photos sont toujours en noir et blanc ! chromosomes ? Ils sont bien plus jolis en relief. PLAN 14

1.3.1 1. Méthodes d’étude. 1.3. Les méthodes de fractionnement. Mais au fait, pourquoi certaines molécules sont solubles et d’autres pas ? 1.3.1 1.3.1. Sédimentation / précipitation. Deux facteurs interviennent: Principe * la masse (c’est logique) Les molécules non solubles se déposent au fond sous l’action de leur propre poids. * l’interaction avec le solvant. Certaine molécules sont capables d’attirer les molécules d’eau qui s’agglutinent autour d’elles. Elles subissent ainsi les effets de l’agitation thermique. Plus elles sont grosses, plus elles précipitent vite ! Mais en fin de compte, elles arrivent toutes en bas. PLAN 15

L’efficacité de la centrifugation dépend de: 1. Méthodes d’étude. 1.3. Les méthodes de fractionnement. Il existe plusieurs types de centrifugation (isopycnic, sur gradient de saccharose, etc...). Vous verrez ça plus tard ! 1.3.2 1.3.2. Centrifugation. Principe C’est le même principe que la précipitation, mais la gravité est remplacée par la force centrifuge. Cela permet de précipiter des molécules plus petites ou des grosses plus rapidement. surnageant L’efficacité de la centrifugation dépend de: * sa vitesse de rotation * sa durée culot PLAN 16

1.3.3 1. Méthodes d’étude. 1.3. Les méthodes de fractionnement. 1.3.3. Chromatographie. Principe On sépare les constituants d’un mélange grâce à la différence d’affinité des éléments pour une phase stationnaire et une phase mobile. phase mobile Si la molécule a tendance à se fixer (forte affinité) sur la phase stationnaire, elle est retenue et descend lentement. Si la molécule est solubilisée dans la phase mobile, elle descend plus vite. phase stationnaire PLAN 17

1.3.3 1. Méthodes d’étude. 1.3. Les méthodes de fractionnement. On caractérise la molécule par: 1.3. Les méthodes de fractionnement. 1.3.3 1.3.3. Chromatographie. le temps de rétention tr temps qu’il faut pour que la molécule parcourt toute la colonne. le volume d’élution Ve volume de tampon nécessaire que la molécule parcourt toute la colonne. I du signal Le graphe est construit en fonction: du temps (temps de rétention: tr) du volume d’éluant (volume d’élution: Ve) tr ou Ve Le capteur mesure les paramètres liés aux molécules: Abs, trouble, fluorescence, conduction,... PLAN 18

1.3.3 1. Méthodes d’étude. 1.3. Les méthodes de fractionnement. 1.3.3. Chromatographie. couche mince Principe échange d’ions Là encore, il existe de très nombreuses techniques différentes en fonction de la nature des phases stationnaire et mobile utilisées. exclusion affinité haute performance (HPLC) Vous les verrez en détail en biotechnologie et en BTS. PLAN 19

Sauf que ce n’est pas tout à fait pareil ! 1. Méthodes d’étude. cathode 1.3. Les méthodes de fractionnement. 1.3.4 1.3.4. Electrophorèse. Principe L’électrophorèse est à la chromatographie ce que la centrifugation est à la précipitation... - + - - + Sauf que ce n’est pas tout à fait pareil ! On sépare les constituants d’un mélange par l’action d’un champ électrique. + + + - Si la molécule est chargée + elle est attirée par le – (anode), si elle est chargée – elle est attirée par la cathode. anode PLAN 20

1.3.4 1. Méthodes d’étude. 1.3. Les méthodes de fractionnement. L’efficacité de la méthode réside dans la mise au point des conditions de l’expérience. 1.3. Les méthodes de fractionnement. 1.3.4 1.3.4. Electrophorèse. Choix du pH Le pH modifie la charge des fonctions acido-basiques et modifie leur migration. Choix de conditions dénaturantes On utilise souvent un détergeant ionique, le SDS Choix de l’intensité du courant électrique et de la durée de la migration - Plus le courant est fort, plus ça va vite - Plus la durée est importante, plus ça va loin. Là encore, vous en apprendrez plus en biotechnologie et en BTS. PLAN 21

1.4 1. Méthodes d’étude. 1.4. Les traceurs isotopiques. PLAN 22 Ce qui intéresse le biologiste, c’est que la radioactivité est facilement mise en évidence (par autoradiographie) ou mesurable (par un compteur type Geiger, Résonance magnétique Nucléaire,...) 1.4 Des isotopes sont des atomes possédant le même numéro atomique (A) mais un nombre de masse (M) différent. Ils ont le même nombre de protons (ils sont de la même espèce chimique) mais un nombre de neutron différent. isotopes lourds (2H, 15N, 18 O) Certains isotopes sont radioactifs. La présence de neutron en plus déstabilise leur noyau qui éclate (il se désintègre). isotopes radioactifs (3H,14C, 35S, 32P, 131I) La radioactivité sera vue en physique. PLAN 22

1.4.1 1. Méthodes d’étude. 1.4. Les traceurs isotopiques. microscope électronique 1.4. Les traceurs isotopiques. film photo 1.4.1 1.4.1. Autoradiographie. lame Principe Une molécule radioactive imprime une tâche noire sur un film photographique. On peut ainsi traquer une molécule dans une cellule. l’isotope se situe au niveau du REG. PLAN 23

On peut ainsi traquer une molécule dans une cellule. 1. Méthodes d’étude. 1.4. Les traceurs isotopiques. 1.4.2 1.4.2. Fractionnement cellulaire. Principe REG Continuons avec la préparation précédente. Séparons les organites par centrifugation puis chromatographie. radio Abs On peut ainsi traquer une molécule dans une cellule. PLAN 24