Principe, intérêts cliniques et standardisation Le « calibrated automated thrombogram » : une technique innovante pour mesurer la génération de thrombine. Principe, intérêts cliniques et standardisation Jonathan Douxfils, Bernard Chatelain, Damien Gheldof, Jean-Baptiste Nicolas, Valentine Minet, Jean-Michel Dogné, François Mullier Réunion Scientifique STAGO Jeudi 16 octobre 2014 Hôtel du Lac, Enghien-Les-Bains 1

Plan Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation La cascade de la coagulation La thrombine comme effecteur central Limites des tests globaux Principe Historique des tests de génération de thrombine Le « calibrated automated thrombogram » Intérêts cliniques Screening des états hypercoagulables Screening des états hypocoagulables Suivi thérapeutique d’agents hémostatiques Standardisation Conclusion

La cascade de coagulation Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

La thrombine comme effecteur central Effets sur l’hémostase: Effet pro-coagulant Effet anticoagulant Effet sur la fibrinolyse Effet plaquettaire Effets pléiotropiques… Siller-Matula JM, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2011;106(6): 1020-33. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Limites des tests globaux TCA et TP Tests globaux basés sur la conversion du fibrinogène en fibrine 5% de thrombine générée sont suffisants au caillot 95% restant sont indetectés De plus, réalisés en absence de thrombomoduline  Influencés par la diminution des effets procoagulants mais pas par la diminution des effets anticoagulants Tripodi A et al. British journal of haematology. 2009;147(1): 77-82. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Limites des tests globaux CONTRASTE: Tests de génération de thrombine Explorent l’hémostase au-délà de cette étape Décrit pour la première fois en 1953 Difficile techniquement et “time-consuming” (sous-échantillonnage régulier dans tes tubes secondaires…) * PPP = Platelet-poor plasma; PRP = Platelet-rich plasma Macfarlane RG, et al. The Journal of physiology. 1953; 6(1): 3-8. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Le test de génération de thrombine Durant la cascade de la coagulation, la thrombine apparait et disparait Prothrombine dans le plasma Prothrombinase convertit la prothrombine Thrombine est formée temporairement Antithrombine Inactive la thrombine Thrombine inactive Adapté de Gerotziafas Gt, Samama MM. Current pharmaceutical design. 2005; 11 (30), 3855-76 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Historique Description des tests chromogéniques en 1986 par Hemker et al. Génération de thrombine suivie par le clivage d’un substrat chromogénique Difficultés: Thrombine est liée à l’antithrombine (site actif) et à l’ α2-macroglobuline (exosite) Thrombine liée à l’ α2- macroglobuline est active sur le substrat >< physiologique Algorythme complexe pour déduire cette activité Hemker HC, et al. Thrombosis and Haemostasis. 1986; 56(1): 9-17. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Le Calibrated Automated Thrombogram Replacement du substrat chromogénique par un substrat fluorogénique permet: Mesure continue de la generation de thrombine dans un milieu contenant du fibrinogène (et fibrine) Mesure dans du PRP influence des plaquette sur la génération de thrombine MAIS: - La relation entre le signal de fluorescence (dF/dt) et la concentration de thrombine varie lorsque la fluorescence augmente - Comment convertir la vélocité du signal de fluorescence (dF/dt) en concentration de thrombine? Hemker HC, et al. Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 2003; 33(1): 4-1. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Le Calibrated Automated Thrombogram Utilisation en parallèle d’un puit contenant une concentration connue en thrombine*. Permet de calculer l’activité de la thrombine en fonction du temps en comparant le signal fluorogénique des deux échantillons. Test “calibré”. f “Calibrated Automated Thrombogram” * Forme utilisée: thrombine liée à de l’α2-macroglobuline Car la thrombine se détériore rapidement dans le plasma Hemker HC, et al. Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 2003; 33(1): 4-1. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Les différents paramètres mesurés en génération de thrombine Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Intérêts cliniques Screening des états hypercoagulables Chez les patients à risque thromboembolique, le TGT peut être utilisé pour détecter des facteurs prédisposants ou héréditaires Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Screening des états hypercoagulables Cancer Syndrome des antiphospholipides Age Hyperhomocystéinémie Obésité Actes invasifs Pathologies hépatiques Trauma Drépanocytose Immobilisation Pré-éclampsie Femmes enceintes Syndromes Myéloprolifératifs Contraception orale Taux sériques bas en 25-hydroxyvitamine D Thérapie hormonale Taux élevés des facteurs II, VIII, IX, XI Taux élevés en microvésicules Résistance à la protéine C activée Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Facteurs acquis : obésité Beijers HJ, et al. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2010; 30(12): 2639-47. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Facteurs acquis : cirrhose hépatique La ratio entre l’ETP obtenu en absence et en presence de TM chez les sujets sains et cirrhotiques est de 0,44 et 0,70, respectivement. Ceci indique que les patients cirrhotiques sont partiellement résistants à l’action anticoagulant médiée par la thrombomoduline Ce ratio est un marqueur d’hypercoagulabilité in-vitro. Tripodi A, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis : JTH 2011; 9(9): 1713-23. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Facteurs acquis : drépanocytose L’accélération dans la phase de propagation (mVRI), menée principalement par Ed-MP/PS+*, est une altération fonctionnelle majeure chez les patients atteints de drépanocytose. Les traitements à base d’hydroxyurée, additionnée à la régulation de l’hémolyse, diminuent les Ed-MPs et diminue la génération de thrombine *Ed-MP/PS+ = Erythrocyte-derived microparticules / phosphatidylsérine + Gerotziafas G., et al. Thrombosis and Haemostasis. 2012; 107(6): 1044-52. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Facteurs héréditaires Déficience en antithrombine Déficience en protéine C Déficience en protéine S Facteur V de Leiden Mutation GA 20210A de la prothrombine Dysfibrinogénémie Polymorphisme au niveau du FT et du TFPI Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Thromboembolie veineuse Chez les patients avec un historique de TEV, les test de thrombophilie ne permettent pas de mettre en exergue les patients présentant un haut risque particulier alors que la génération de thrombine est augmentée chez ces mêmes patients. Cependant ces données nécessitent d’être consolidées. Ten Cate H. Thrombosis Research. 2012; 129(3):367-70 Baglin T. International Journal of Laboratory Hematology. 2011; 33(4):333-42 ten Cate-Hoek AJ, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2008;100(2):240-5 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Thrombose veineuse profonde ten Cate-Hoek AJ, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2008;100(2):240-5 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Thrombose veineuse profonde A l’opposé, il existe des investigateurs qui estiment que les paramètres en TGT ne sont pas appropriés si utilisés seuls pour exclure des thrombosis veineuses profondes (sauf chez les patients âgés) L’hypothèse proposant l’utilisation à la fois des D-dimères et du TGT pourrait améliorer les performances, mais doit être testée. Haas FG, et al. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 2011;71(1):12-8. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Pathologies vasculaires artérielles Chez les patients présentant des pathologies vasculaires artérielles, un effet marqué est retrouvé sur les paramètres du TGT. Ceci reflète le phénomène d’athérosclérose mais aussi les facteurs de risques et est également lié au risque de recurrence. Dans l’étude GLAMIS, les patients avec un antécédent d’infarctus du myocarde avaient une génération de thrombine augmentée. L’addition de thrombomoduline à ces tests ont permis de montrer que la fonction anticoagulante n’était pas altérée Smid M, et al. PloS one. 2013; 8(6):e066977 Smid M, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011; 9(3).450-6 Skeppholm M, et al. Thrombosis Research. 2011;128(5):483-9 Abbate R, et al. Thrombosis Research. 2012; 129(3):235-40 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Pathologies vasculaires artérielles Smid M, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011; 9(3).450-6 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Intérêts cliniques Screening des états hypocoagulables Le TGT permet le screening des états hypocoagulables, ce qui est important chez les patients hémophiles La prédiction du risque de saignement chez les hémophiles ainsi que la réponse à leur traitement (concentré de facteur(s) or rFVIIa) reste néanmoins un challenge Ten Cate H. Thrombosis Research 2012; 129(3); 367-70 Dargaud Y. Negrier C. Haemophilia 2010; 16(2):223-30 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Etats hypocoagulables Des études démontrent qu’il existe un lien entre les saignements observés chez les patients hémophiles et leur capacité à générer de la thrombine En général, les patients avec un ETP < 50% la normale et un pic < 30% la normale représentent une population ayant des saignements majeurs. Ten Cate H. Thrombosis Research 2012; 129(3); 367-70 Dargaud Y. Negrier C. Haemophilia 2010; 16(2):223-30 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Etats hypocoagulables Chez les patients hémophilies, la phase d’initiation (et donc le TCA et le TP) est moins affectée que la phase de propagation (Josso Loop) montrant la sensibilité accrue du TGT pour évaluer ces patients Le TGT a permis de distinguer également des profils différents chez des hémophiles A qui avaient des taux similaires de FVIII  Individualisation de l’évaluation du risque de saignement et explication à l’hétérogénéité phénotypique rencontrée pour des mêmes taux de FVIII Un faible generation de thrombine a également été observée chez les hémophiles A avec inhibiteurs Chitlur M. Thrombosis Research 2012; 130(1); 1-6 Nair SC, et al. Haemophilia 2010; 16 Suppl 5:85-92. Gilmore R. Haemophilia 2010; 16(4):671-74 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Etats hypocoagulables Finallement, le TGT peut également étudier d’hypocoagulabilité rencontrés après une chirurgie cardiaque ou dans la maladie de von Willebrand Radulovic V. Thrombosis Research 2012; 130(5); 769-74 Salvagno GL. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 2010; 36(7):380-90 Solomon C. Thrombosis Research; 2011. 128(3):277-82 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Intérêts cliniques Suivi des agents hémastatiques In-vivo, le TGT peut être utilisé pour évaluer la prise en charge des coagulopathies dilutionelles periopératoire avec du plasma frais congelé ou du concentré de fibrinogène group A received 4 units FFP and group B received 2 units FFP plus 2 g fibrinogen concentrate. Lancé, MD. Vox Sanguinis 2012; 103(1): 25-34 Schols, SE. Thrombosis and Haemostasis; 2008. 99(1). 64-70 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Suivi des traitements anticoagulants/antiagrégants Le TGT peut être utile pour comparer l’efficacité et la sécurité des agents anticoagulants/antiagrégants administrés chez les patients souffrant de syndrome coronaire aigu Il est important de pouvoir surveiller la contribution des deux types de traitement car leur association peut être fréquente et est étroitement correlée au risque de saignement. Campo G, et al. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 2012. 23(8). 680-7 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Suivi des traitements anticoagulants/antiagrégants Le TGT peut être également utile pour monitorer les HNF et les HBPM al Dieri R, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2004; 2(8):1395-401 al Dieri R,et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2006; 4(1): 83-89 Gatt A, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2008; 100(2):350-55 Hemker HC, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2005; 3(3): 571-73 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Suivi des traitements anticoagulants/antiagrégants Le TGT est utile pour les patients traités par NOACs même si ces derniers ne nécessitent pas (…) de suivi fréquent de l’anticoagulation Douxfils et al. Thrombosis and Haemostasis. 2012. 107(5):985-97 Douxfils et al. Thrombosis Research. 2012. 130(6):956-66 Douxfils et al. Thrombosis and Haemostasis. 2013. 110(2):283-94 Samama MM, et al. Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2013. 35(2):140-6 Dale B, et al. Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2013. 35(2):295-301 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Suivi des traitements anticoagulants/antiagrégants Le TGT pour aussi être utilisé pour montrer que l’inhibition du TFPI par un aptamère (BAX499) améliore la coagulation chez les patients hémophiles Gorczyca ME, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2012; 10(8):1581-90 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Suivi des traitements antiagrégants, statines, antiprotéinuriques Les formulations à libération prolongées de dypiridamole montrent une diminution de l’ETP et un Lag Time prolongé Les statines diminuent la génération de thrombine (ETP) Les traitements antiprotéinuriques améliorent l’état prothrombotique de ces patients Serebruany V, et al. American Journal of Therapeutics. 2012; 19(6):407-12 Mobarrez F, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2011; 106(2):344-52 Macchia A, et al. PLoS One. 2012;7(3):e32894 Mahmoodi BK, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011; 9(12):2416-23 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Suivi des « antidotes » ou « reversal agents » Les NOACS sont responsables de complications hémorragiques L’absence d’antidote spécifique a forcé l’évaluation de la capacité du PCC, rFVIIa et du Feiba à restaurer l’hémostase in-vitro grâce au TGT De plus, lorsque des antidotes (en cours de développement) seront disponibles, il sera important d’avoir à disposition des tests fiables pour confirmer l’efficacité de ces traitements. Eerenberg ES, et al. Circulation 2011;124(14):1573-9 Marlu R, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2012; ;108(2):217-24 Escolar G, et al. PLoS One. 2013;8(11):e78696 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Standardisation Malgré la présence de nombreuses études mentionnant l’intérêt du TGT, la majorité des résultats obtenus ne sont pas directement comparable à cause d’un manque de standardisation Gerotziafas G, et al. Throbosis Journal. 2005; 3: 16 Dargaud Y, et al. Thrombosis Reserach. 2010; 125(4): 353-6 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Standardisation Divers paramètres influencent le TGT: Le plasma du patient (the inner-filter effect) Variables pré-analytiques (type de tube, prélèvement à l’aiguille versus “butterfly”,…) Le type de réactif: PPP-Reagent (1pM TF + 4µM PL) PPP-Reagent High (20pM TF + 4µM PL) PPP-Reagent LOW (5pM TF + 4µM PL) MP-Reagent (4µM PL) PRP Reagent (1pM TF) + réactifs “home made” Le lot du réactif La dilution finale de l’échantillon (différentes techniques selon les différents manufacturiers) … De Smedt E, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2008; 100(2):343-49 Spronk H, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2008. 100(2):362-64 De Smedt E, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2009; 101(1):165-70 Loeffen R, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2012; 10(12):2544-54 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

a permis de réduire la variabilité du TGT Standardisation Des études ont été menée afin de tenter de réduire la variabilité intra-essai, inter-essai et également inter-centre utilisation d’une procédure standardisée (préchauffage des réactifs et du plasma) utilisation des mêmes lots de calibrateurs, réactifs (utilisation de corn thrypsin inhibitor (CTI)) normalisation des résultats (>< plasma normalisé) a permis de réduire la variabilité du TGT De Smedt E, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011; 9(1): 233-34 Dargaud Y, et al. Thrombosis Reserach. 2010; 125(4): 353-56 Dargaud Y, et al. Thrombosis Research. 2012; 130(6): 929-34 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Standardisation Introduction Principe Intérêts cliniques Dargaud Y, et al. Thrombosis Research. 2012; 130(6): 929-34 Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Standardisation Introduction Principe Intérêts cliniques Conclusion

Standardisation Introduction Principe Intérêts cliniques Conclusion

Standardisation Introduction Principe Intérêts cliniques Conclusion

Standardisation Introduction Principe Intérêts cliniques Conclusion

Conclusions Actuellement, le TGT est utilisé pour screener les états hypo- et hyper coagulables ainsi que leur implication dans les évènements cliniques. Ce test sert également à mieux comprendre la physiopathologie de certaines maladies thrombotiques et peut aider le clinicien dans le choix raisonné de l’utilisation des outils thérapeutiques disponibles Il permet de suivre les traitements anticoagulants, antiagrégants et d’évaluer la réponse du patient lors de l’administration de divers antidotes. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

Conclusions L’applicabilité de cette technique globale au niveau de la clinique nécessite une standardisation importante des procédures, tant pré-analytique qu’analytique. L’automatisation d’un tel test de même que sa realisation dans du sang total sont des perspectives (d’avenir?) qui vont probablement faciliter l’accès à cet outil de diagnostique sensible sur l’ensemble du processus de coagulation. A l’avenir, il pourrait être intéressant de combiner ce test avec la thromboelastographie ou un test mesurant la generation de plasmine afin de mieux élucider encore les mécanismes sous-jacent des perturbations de l’hémostase. Introduction Principe Intérêts cliniques Standardisation Conclusion

En mémoire du Professeur Samama.

Merci pour votre attention Jonathan Douxfils, Bernard Chatelain, Damien Gheldof, Jean-Baptiste Nicolas, Valentine Minet,Jean-Michel Dogné, François Mullier Merci pour votre attention