Adhérence et circulation des lymphocytes

1673 : Description des Globules sanguins par Leeuwenhoek 1964 : Gowans et Knight 1983 : Gallatin, Weissman et Butcher

Thymus Secondary lymphoid tissue (LN, spleen, PP) Bone marrow Blood Pre T T cells Stem cells naive lymphocytes Pre T naive lymphocytes Pre B Pre T Ag presentation B cells Memory lymphocytes Memory lymphocytes Blood Memory lymphocytes afferent lymphatics Peripheral non lymphoid tissue

Géneralités Les cellules du systeme immunitaire ne fonctionnent pas de facon isolée : la maturation ou l’activation necessite des interactions avec de nombreux types cellulaires directement ou par le biais de molecules secretees : on parle de microenvironnement. Les lymphocytes en particulier naissent, maturent et sont activés dans des lieux bien précis de l’organisme - les organes lymphoides primaires et secondaires. Ces sites sont differents selon que l’on a affaire a des cellules naives ou a des cellules effectrices/memoire Ils doivent ensuite aller a la rencontre de l’antigene qui peut etre situé n’importe ou dans l’organisme (par exemple hépatocyte infecté par un virus) pour l’éliminer. Les lymphocytes doivent donc etre capable de circuler entre ces différentes zones, le sang et la lymphe servant de “moyen de transport”. Les molecules et les mecanismes impliqués dans ces situations sensiblement les memes : on prendra pour exemple l’interaction des lymphocytes avec les cellules endotheliales et la facon dont ils quittent le lit vasculaire.

Fig.2 : les différentes étapes conduisant au passage des lymphocytes du sang vers les tissus.

les selectines et les integrines a4 Les molecules impliquees dans les etapes precoces (interactions faibles et roulement) : les selectines et les integrines a4

Les sélectines La famille des sélectine est composée de 3 membres (P-, E-, L-sélectine) et sont impliquées dans les phénomènes de roulement des leucocytes le long de l’endothélium. Les P-sélectines Présentes sur les cellules endothéliales et les plaquettes. Stockées dans des granules, elles transloquent rapidement à la membrane sous l’influence de stimuli inflammatoires Des cytokines inflammatoires (comme le TNF-a et l’IL-1) entraînent une augmentation de la synthèse. Impliquées dans la migration vers les sites inflammatoires (cellules mémoires et effectrices) Les E-sélectines présentes uniquement sur l’endothélium Leur expression est régulée par les cytokines inflammatoires Les L-sélectines Exprimées à la surface de sous-populations leucocytaires Rapidement effeuillées après activation Migration vers organes lymphoides secondaires (cellules naives et sous populations mémoire)

Les sélectines Leurs fonction adhésives passent par la reconnaissance de contre-récepteurs composés de molécules sucrées (principalement tétra-saccharides sialyl Lewisx, sLex) qui sont fixés sur des cores protéiques. Le principal ligand est la molécule PSGL-1 qui reconnaît les 3 selectines. Les L-sélectines reconnaissent des ligands exprimés sur les HEV des GG (PNAd, CD34) et des PP (MadCAM-1)

HEV Binding of Lymphocytes from Normal Mouse and L-Selectin-Deficient Mouse control mouse (+/+) L-selectin-deficient mouse (-/-) Arbones et al. Cell, 1994, 1, 247

les selectines et les integrines a4 Les molecules impliquees dans les etapes precoces (interactions faibles et roulement) : les selectines et les integrines a4

Les intégrines Les intégrines sont des hétérodimères (ab) exprimées constitutivement à la surface des leucocytes (et de presque toutes les cellules). Elles sont impliquées dans les interactions cellules-cellules et cellules-matrice extra cellulaire Actuellement 19 chaînes a et 8 chaînes b ont été identifiées qui forment 25 hétérodimères (1 chaîne a peut se lier à plusieurs chaînes b). Dans la circulation 4 intégrines sont importantes : Famille b2 : LFA-1 (ou aLb2) et Mac-1 (aMb2), Famille a4 : VLA-4 (ou a4b1), a4b7)

Les intégrines Leur expression est extrêmement variable d’un type cellulaire à l’autre. Certaines sont restreintes à des types cellulaires ou des lignées (b2 intégrines et leucocytes, aEb7 et lymphocytes muqueux) Leur importance a été mis en évidence dans des défauts génétiques chez l’homme : GT mutations GPIIb/IIIa LAD I et LAD I variants (ou LAD III) Épidermolyses bulleuses (a4b6) Congénital myopathies (mutations de la chaîne a7)

Les intégrines Elles se présentent à la surface des leucocytes dans un état de basse affinité pour leurs ligands Après activation elles deviennent capables de reconnaître leurs ligands situés sur d’autres cellules (endothelium par exemple) ou présents dans la matrice extra-cellulaire : Protéines de la matrice extra-cellulaire : FN, TSP, VN, collagène Molécules de surface : ICAMs, VCAM, MadCAM... L’activation est déclenchés par différents stimuli : peptides bactériens, chimiokines, TCR... Ce mécanisme d’activation est induit 2 phénomènes : L’augmentation affinité : changement conformationnel L’augmentation d’avidité : diffusion latérale permettant la formation de cluster d’intégrines Elles sont impliquées dans les phénomène d’arrêt ferme et de roulement des leucocytes le long de l’endothélium.

Les molecules impliquees dans l’arret ferme des lymphocytes : les integrines de la famille a4 et b2

Les (nombreuses) autres fonctions des intégrines

Les molécules impliquées Sélectines et leurs ligands Intégrines (b2 and a4) et leurs ligands Chimiokines et leurs récepteurs

Fig.2 : les différentes étapes conduisant au passage des lymphocytes du sang vers les tissus.

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques) Initialement identifiées comme une famille de petites molécules induites par l'inflammation et capables d'attirer les leucocytes au cours de l'inflammation. Plus de 50 identifiées à ce jour protéines de 8 à 10 kDa avec 20-70 % homologie Toutes les chimiokines (sauf 2 qui sont fixées à la membrane plasmique) sont sécrétées.

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques) Elles permettent d’activer les intégrines et d’induire une adhérence forte et d’attirer les leucocytes Elles permettent de contrôler la circulation des leucocytes dans les tissus et les organes lymphoïdes (par exemple si on élimine CCR7 le récepteur de certaines chimiokines homéostatiques la structure des OLS est très altérée…et la réponse immune aussi) Au cours de l’inflammation la sécrétion de chimiokines est augmentée considérablement et permet l’afflux des leucocytes dans les tissus inflammatoires.

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques) Sont classifiées sur un plan structural en 2 grandes sous-familles (comprenant plus de 50 chimiokines) avec 2 ponts disulfures et 4 cystéines dont les 2 premières sont séparées par un acide aminé (a chemokines, CXC) ou pas (b chemokines, CC). Il existe 2 sous-familles mineures appelées C chimiokines (2 chimiokines les lymphotactin a et b XCL1 et 2) et CX3C chimiokine (Fractalkine). Classification physiologique : - inflammatoires (ou inductibles) - homéostatiques (ou constitutives, lymphoïdes) - double fonctions : inflammatoire et homéostatiques

Les 4 familles de Chimiokines CXC chimiokines CC chimiokines

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques) Chimiokines inflammatoires (ou inductibles) Leur source majeure sont les cellules endothéliales activées, les cellules épithéliales, les leucocytes (mais après activation - LPS - pratiquement n’importe quelle cellule peut en produire) Elles sont peu spécifiques agissant sur les cellules de l’immunité naturelle et acquise. Elles contrôlent le recrutement des cellules effectrices au cours de l’inflammation, des infections, des tumeurs, des lésions tissulaires Chimiokines homéostatiques (ou constitutives, lymphoïdes, housekeeping) produites principalement dans les tissus lymphoides. elles contrôlent la circulation des leucocytes au cours de l’hématopoïèse (MO, Thymus), de la surveillance des tissus, de l’initiation de la réponse immune (circulation entre GG, rate, plaques de Peyer).

Les Chimiokines (ou cytokines chimiotactiques) In vivo les chimiokines sont immobilisées sur la matrice extra-cellulaire ou à la surface cellulaire liée à des glycosaminoglycans. Permet de faire des gradiants (évite que les chimiokines soient emportées dans le torrent circulatoire par exemple) Il existe 2 régions dans la partie Nt permettant La fixation à un récepteur spécifique La fixation à la matrice ou à la surface cellulaire

Les récepteurs des chimiokines Molécules heptaspanes. Une vingtaine de récepteurs connus actuellement. 7 CXCR (récepteur des a chemokines) ; 11 CCR (récepteur des b chemokines) ; 1 CX3CR ; 1 XCR. Sont également exprimés sur d’autres types cellulaires (neurones, cellules épithéliales, endothéliales...) suggérant d’autres rôles que le chémotactisme Les couples chimiokines-récepteurs ne sont en général pas spécifiques Egalement récepteurs d’agents infectieux (HIV, paludisme)

Un exemple d’expression de chimiokines et de recepteurs de chimiokines en dehors du systeme immunitaire : le cerveau de rat et CCL2/CCR2

Les récepteurs des chimiokines : leur régulation est complexe mais cela permet de contrôler très finement la RI certains sont d’expression restreinte (CXCR1 prédominant sur PN) d’autres sont d’expression plus large (CCR2 ou CXCR4 monocytes, lymphocytes T, NK, cellules dendritiques, basophiles) certains sont constitutivement exprimés (CCR1 et CCR2 sur les monocytes) d’autres n’apparaissent qu’après activation (CCR1 et CCR2 sur les lymphocytes T activés par l’IL-2) d’autres sont down-modulés (CCR2 par le LPS) certains sont exprimés à un stade précis de l’activation : Les lymphocytes T de type Th2 expriment CCR4, CCR8 (les basophiles, les éosinophiles CCR3) les Th1 activés expriment CXCR3, CCR5

Les chimiokines et leurs récepteurs sont des acteurs majeurs dans la différenciation/maturation lymphocytaire Le contrôle de la migration durant les différentes étapes de différenciation et de maturation est dépendant : de l’expression de récepteurs de chimiokines à la surface cellulaire qui vont varier selon le stade de maturation La présence de chimiokines particulières dans un microenvironnement donné Les chimiokines homéostatiques et ‘dual function’ sont exprimées constitutivement dans les organes lymphoïdes primaires et leur récepteurs sur les précurseurs. Elles sont impliquées ensuite dans la circulation des cellules naïves, mémoires effectrices et centrales.

La traversee de l’endothelium

La traversee de l’endothelium

Les molécules d’adhérence et leurs ligands, les chimiokines et leurs récepteurs permettent (ou pas) l’entrée des leucocytes dans un tissu

Lymphocytes naïfs (T+B) L-selectin/PNAd CCR7/SLC LFA-1/ICAM-1 CCR7/ELC Lymphocytes naïfs (T+B) CCR7/ELC ou CXCR5/BLC

Lymphocytes mémoire à tropisme digestif a4b7/MAdCAM-1 CCR9/TECK LFA-1/ICAM-1 a4b7/MAdCAM-1 CCR9/TECK Lymphocytes mémoire à tropisme digestif CCR9/TECK

Lymphocytes mémoire à tropisme cutané CLA/E-sélectine a4b1/VCAM-1 CCR4/TARC CCR10/CTACK LFA-1/ICAM-1 a4b1/VCAM-1 CCR10/CTACK Lymphocytes mémoire à tropisme cutané CCR10/CTACK

Chimiokines et immunité non spécifique Les chimiokines jouent également un rôle important dans les liens entre immunité innée et immunité acquise. En particulier les cellules dendritiques activées par des dérivés microbiens (peptidoglycans des BGP, lipoprotéines bactériennes, DNA bactérien contenant des dinucléotides déméthylés CpG) et chargées de l’antigène migrent vers les organes lymphoïdes secondaires pour activer le système immun spécifique. De plus les macrophages et les cellules dendritiques activés, en périphérie sécrètent des chimiokines qui attirent différentes classes de leucocytes.

2. L’activation des cellules dendritiques via les TLR module l’expression de certains récepteurs de chimiokines leur permettant de quitter la périphérie pour aller vers les lymphatiques, direction les organes lymphoïdes secondaires.

2. Après activation et phagocytose de l’antigène, elles expriment du CCR7 et entrent dans les lymphatiques, direction organes lymphoïdes secondaires. 4. Au niveau du site inflammatoire, la sécrétion de chimiokines permet d’attirer et de faire entrer les lymphocytes effecteurs et mémoires. 1. Les cellules dendritiques immatures quittent le sang et entrent dans les tissus grâce à des récepteurs de chimiokines (CCR1, 2, 5, 6, 9, CXCR4) 3. Dans les organes lymphoïdes secondaires, présentation de l’antigène.

4. Au niveau du site inflammatoire, la sécrétion de chimiokines induite par les TLR permet d’attirer et de faire entrer les leucocytes.

4. Au niveau du site inflammatoire, la sécrétion de chimiokines par les CTLs permet de recruter et d’amplifier la réponse immune.

Les chimiokines et la migration des cellules effectrices Après leur rencontre avec l’antigène dans les organes lymphoïdes, les lymphocytes se différencient en cellules effectrices Th1 ou Th2 et migrent vers les tissus périphériques où se trouvent les agents pathogènes. Les Th1 expriment préférentiellement CCR5 et CXCR3 (récepteurs de chimiokines inflammatoires) retrouvés aussi sur les macrophages activés. Ils ont une importance considérable dans de nombreuses maladies (MS, RA, diabète de type 1, Crohn, athérosclérose, psoriasis, rejet de greffe). Les personnes CCR5 deficientes pourraient être moins sensibles aux maladies inflammatoires. Les Th2 responsables de la défense contre les parasites (et impliqués dans les maladies allergiques type asthme, allergies alimentaires, dermatite atopique) expriment plutôt CCR4 et CCR8. CCR3 est exprimé sur les éosinophiles, basophiles, mastocytes.

2 exemples de maladies principalement Th1 ou Th2 : les mécanismes impliqués dans la migration tissulaire sont identiques (même si les molécules sont différentes).

Molécules d’adhérence et chimiokines en pathologie - Quelques exemples

LAD (Leukocyte Adhesion Deficiency Disease) LAD type I : Mutation dans le gène codant pour CD18 Pas d’expression en surface des intégrines de la famille b2 (En fait, différents niveaux d’expression) Le fonctionnement des neutrophiles est fortement altéré car ils utilisent les b2 intégrines pour adhérer à l’endothélium, migrer, ingérer des microorganismes recouverts de C3bi : grande sensibilité aux infections bactériennes. Pas d’infections virales majeures ni de trouble de HSR (compensation par d’autres intégrines) Les formes graves : greffe de moelle LAD I variants (ou LAD type III) Expression normale ou légèrement diminué des intégrines b1, b2 et b3 Fonction très altérée des intégrines (avec troubles hémorragiques comme dans GT) Défaut d’activation commun « inside-out » LAD type II : Défaut congénital de fucosylation des ligands des sélectines (et d’autres glycoprotéines) Anomalies infectieuses proches des LAD-I (mais moins sévère en particulier car à faible vitesse l’adhérence à l’endothélium reste possible) Retard mental, troubles de croissance, groupe sanguin de type Bombay Defaut de transport de ADP-fucose du cytoplasme vers le RE

HIV Gp120/gp41 viral se fixe sur le CD4 (sous-population des cellules T et macrophages) Co-récepteurs : CXCR4 (entrée dans les cellules T) et CCR5 (entrée dans les macrophages et T activés)

Les mecanismes d’entree du VIH dans les lymphocytes T

HIV Les cellules effectrices CD4 Th1 sont CCR5/CXCR3 : elles migrent dans les tissus périphériques en particulier au niveau des sites de transmission virale comme la muqueuse génitale et digestive. Elles sont infectées en premier (souches virales R5) et en retournant vers le sang et les organes lymphoïdes favorisent la dissémination virale. L’atteinte de ces cellules altère la réponse antivirale (Th1 effectrices). Le virus est ensuite libre d’infecter les cellules CD4 CXCR4 (cellules naïves qui recirculent entre les organes lymphoïdes). L’apparition des virus X4 (coexistence de souches R5 et X4) est associée à une accélération de la chute des CD4 et à une progression clinique de la maladie Il est probable que la pression du système immun entraîne une diversification de gp120 et une altération de l’usage des co-récepteurs. Application : développement de bloqueurs des co-récepteurs (petites molécules, peptides, anticorps, chimiokines altérées…)

Les souches virales R5 (anciennement dites à tropisme mono/macrophage) et X4 (anciennement dites à tropisme lymphocyte T)

HIV Homozygotes CCR5 D32 et hétérozygotes Associé également (dans certaines études) à un risque diminué (asthme), une évolution moins sévère (polyarthrite rhumatoïde), un début retardé de la maladie (slérose en plaque). Déplétion des lymphocytes CD4+ du tractus digestif (CCR5+).

Rejets au cours des transplantation Au cours de la reperfusion (après la phase d’ischiémie) il y a sécrétion de nombreuses chimiokines qui attirent les lymphocytes, monocytes, cellules présentatrices. Au cours du rejet aigu on trouve dans les biopsies rénales des chimiokines et leurs récepteurs associées aux Th1 (comme CCR5 et CXCR3) : les rejets d’organes dans ces modèles de souris KO sont très retardés.

Chimiokines et cancer De nombreux cancers humains produisent des chimiokines et expriment des récepteurs de chimiokines. La production de chimiokines, l’expression des récepteurs des chimiokines et leur signalisation sont modifiés Les conséquences : Contrôler l’importance et la composition de l’infiltrat leucocytaire Permet de modifier la réponse immune Favorise l’angiogénèse Favorise la croissance de la tumeur (croissance et apoptose) Migration et métastases

Cancer Les récepteurs des chimiokines peuvent être exprimés sur des cellules cancéreuses et contribuer à l’apparition de métastases dans des lieux précis (cancer du sein et mélanomes malins) Cancer du sein : expriment CXCR4 et CCR7 dont les ligands se trouvent dans les ganglions, le foie, les poumons, la moelle osseuse Mélanomes malins expriment en plus CCR10 (dont le ligand CTACK est exprimé au niveau de la peau)

Les CAMs leucocytaires et endothéliaux cibles de l’immunothérapie dans les maladies inflammatoires ? L’inflammation est une réponse physiologique majeure (et bénéfique) de l’organisme à l’invasion d’agents infectieux et à l’agression tissulaire Inappropriée, non ou mal contrôlée, persistante, elle devient néfaste et conduit à, contribue à ou aggrave de nombreuses pathologies (ischiémie-reperfusion, maladies inflammatoires, auto-immunes…) Le recrutement des leucocytes sanguins vers les tissus est essentiel à la réaction inflammatoire. Survient au cours d’un processus comprenant plusieurs étapes séquentielles (et plus ou moins superposées) Le blocage d’une de ces étapes (par interférence avec une molécule clef) devrait permettre de bloquer le processus dans son ensemble

Les CAMs leucocytaires et endothéliaux cibles de l’immunothérapie dans les maladies inflammatoires ? Suppression des CAMs à la surface des cellules endothéliales en inhibant le TNF-a ou l’IL-1 (AcM, récepteurs solubles). Les corticostéroïdes, les AINS inhibent l’expression des CAMs inflammatoires et des chimiokines (en particulier en interférant avec la voie NF-kB). Les statins bloquent l’activation des intégrines (bloquent l’activation de Rap1 - « inside-out »).

Les intégrines cibles de l’immunothérapie dans les maladies inflammatoires : beaucoup d’études mais des résultats décevants ?

Les CAMs leucocytaires et endothéliaux cibles de l’immunothérapie dans les maladies inflammatoires ? Des modèles précliniques très prometteurs Des résultats cliniques décevants pour les sélectines et l’intégrine b2 (avec des exceptions comme le psoriasis, asthme) en particulier dans les syndromes d’ischiémie-reperfusion. Surestimation de l’importance réelle de ces voies ? Voies redondantes ? L’effet des anti-aL pourrait être secondaire à d’autres effets que le blocage de LFA-1 (en particulier intervient dans la présentation de l’antigène) A l’opposé cibler les a4 intégrines est efficace dans plusieurs maladies (comme la sclérose en plaque) Maladies pour lesquelles les lymphocytes jouent un rôle prépondérant Autres modes d’action (exocytose, production de cytokine, motilité..) Moins immunosuppresseur que les anti-b2 (qui miment LAD-I & II) Efficacité et effets secondaires à long terme ?

L’exemple de la sclérose en plaque

L’exemple du psoriasis

Le rapport benefice/risque ? NEJM 2005, July Brief Report: Progressive Multifocal Leukoencephalopathy after Natalizumab Therapy for Crohn's Disease G. Van Assche and Others Summary | Full Text | PDF Brief Report: Progressive Multifocal Leukoencephalopathy Complicating Treatment with Natalizumab and Interferon Beta-1a for Multiple Sclerosis B.K. Kleinschmidt-DeMasters and K. L. Tyler Brief Report: Progressive Multifocal Leukoencephalopathy in a Patient Treated with Natalizumab A. Langer-Gould and Others