Transfert d’un phénotype d’un organisme à un autre

Introduction On veut introduire un plasmide contenant la séquence d’ADN codant pour la protéine GFP dans des bactéries pour qu’elles acquièrent les caractéristiques de fluorescence de la GFP.

Extraction du plasmide de la bactérie Extraction et modification du plasmide Extraction du plasmide de la bactérie Insertion des gènes codant pour la fluorescence (GFP) et pour la résistance à la kanamycine 1 : ADN Génomique 2 : Plasmides GFP Gène de résistance à la Kanamycine On extrait le plasmide contenant une part de l’ADN de la bactérie. Il est utilisé comme outil génétique car il est facilement manipulable. On insère dans le plasmides la séquence d’ADN codant pour la protéine GFP et celle codant pour la résistance à la Kanamycine. La kanamycine sera ajoutée au milieu de culture des bactéries afin de tuer toutes celle qui n’ont pas intégré le plasmide et ne sont donc pas résistantes à celle-ci

Obtention de bactéries compétentes Ajout des plasmides Bactéries contenant le plasmide modifié On rajoute ensuite du milieu LB puis on fait incuber les bactéries à 37° pendant 30 minutes afin de les laisser proliférer. Bain Marie CaCl2 Bactéries 42° Le CaCl2 crée des pores dans la paroi des bactéries afin d’y laisser pénétrer les plasmides. On crée un choc thermique pour refermer les pores de la paroi

Etalement des bactéries On étale les bactéries obtenues précédemment sur un milieu LB contenant de la kanamycine. La kanamycine détruira toutes les bactéries n’ayant pas le plasmide résistant à l’antibiotique et donc pas la GFP. Cela permet donc de ne sélectionner que les bactéries ayant intégré le plasmide contenant l’ADN qui code pour la GFP. Milieu LB Contenant Ampiciline Contenant Kanamycine Bactéries Témoin Les bactéries qui se sont développées prouvent que le plasmide à bien été intégré par les bactéries car celles-ci ont résisté à l’antibiotique. L’ampiciline a détruit toutes les bactéries car elles ne possèdent pas de résistance à cet antibiotique. Contenant le plasmide codant pour la GFP et résistante à la kanamycine. Les bactéries se sont développées comme on l’attendait, elle sont bien résistantes à la kanamycine. Ces résultats ne concordent pas avec les résultats attendus, ils peuvent provenir d’une résistance naturelle à l’antibiotique ou d’un antibiotique défaillant, voire d’une erreur de manipulation. Sans plasmide et résistante à la kanamycine. Contenant un plasmide non modifié On laisse incuber les bactéries durant la nuit. L’ampiciline a détruit les bactéries car elles ne possédaient aucune résistance à un antibiotique.

Récupération des plasmides Pour s’assurer de la présence des plasmides contenant l’ADN codant pour la GFP, on tente de les récupérer à l’intérieur des bactéries.

On lyse les bactéries de façon à récupérer les plasmides On lyse les bactéries de façon à récupérer les plasmides. Puis, après plusieurs réactions enzymatiques, on récupère la section du plasmide codant pour la GFP. … qui isolent la section d’ADN codant pour la GFP. Action des enzymes…

Afin de vérifier que la section d’ADN récupérée est bien celle codant pour la GFP, on coule ensuite un gel d’agarose dans lequel on compare la migration des plasmides avec celle d’un marqueur sous une lampe UV. Bande correspondante au plasmide Marqueur Bande correspondante à la section codant pour la GFP

Réalisé par : - HELICK Julien TANI Emilie GRARD Jérôme BOTZANOWSKI Thomas CERAULO Hugo