Chapitre 2 titre Enzymologie 1ère partie

plan 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.1. Propriété des catalyseurs. 1.1.2. Créer un environnement favorable. 1.2. Relation enzyme / substrat. 2. Les paramètres enzymatiques. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.1. Reconnaissance du Substrat. 2.1.2. Vitesse de catalyse. 2.1.3. Concentration en substrat. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.1. Cinétique enzymatique. 2.2.2. Représentation de Michaelis. 2.2.3. Représentation de Lineweaver et Burk. 2.2.4. Pour le plaisir: Eisenthal et Cornish-Bowden. 2.2.5. Méthodes de détermination des paramètres. 2.2.6. Les unités. 3. Les iso-enzymes.

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques. 1. Mécanisme de catalyse. Les catalyseurs sont des molécules qui accélèrent la vitesse d’une réaction. 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.1 1.1.1. Propriété des catalyseurs. Ils possèdent des propriétés caractéristiques. Ils ne subissent pas la réaction. (Ils n’apparaissent pas dans l’équation globale). Ils ne modifient pas l’équilibre de la réaction. Ils ne modifient pas l’énergie de la réaction. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques. Ce sont des protéines. Cependant, on a mis en évidence chez certains ARN des propriétés catalytique. Ils sont des milliers de fois plus efficaces que les catalyseurs chimiques. PLAN 3

1.1.1 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. Les catalyseurs sont des molécules qui accélèrent la vitesse d’une réaction. 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.1 1.1.1. Propriété des catalyseurs. Calculer le facteur d’augmentation de la vitesse de réaction. Temps nécessaire à la transformation de la moitié des réactifs. Nombre de réactions par seconde. Approximativement: T1/2 / tréac Phosphodiestérase 2,9 ans 2 100 Anhydrase carbonique 5 s 1.106 enzyme T1/2 non enzymatique Nombre de cycles Décarboxylase d’OMP 78 000 000 ans 39 Augmentation de la vitesse 1,4.1017 2,7.1011 7,7.106 Voir le cours de première !  enzyme intervient dans la biosynthèse des pyrimidines Dégrade AMPc par exemple Réaction dans le GR CO2 + H2O ---> HCO3- + H+ PLAN 4

Exemple: aldolisation Dihydroxyacétone phosphate 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. Exemple: aldolisation 1.1.1 1.1.1. Propriété des catalyseurs. L’enzyme catalyse la réaction dans les deux sens. CH2PO4 O OH CH2PO4 O OH La conformation des produits est analogue à celle du substrat seul. CH2PO4 C O CH2OH CHO CHOH CH2PO4 Dihydroxyacétone phosphate DHP Glycéraldéhyde 3 phosphate G3P PLAN 5

1.1.2 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. H2O 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.2 1.1.2. Créer un environnement favorable. La forme compacte interdit l’intrusion de molécules parasites (eau). La forme permet l’orientation optimale des réactifs. PLAN 6

Les deux structures doivent être les plus complémentaires possibles. 1. Mécanisme de catalyse. La reconnaissance est la première étape de l’activité enzymatique. Il s’agit de la fixation du substrat sur le site spécifique de l’enzyme. 1.2. Relation enzyme / substrat. 1.2 Les deux structures doivent être les plus complémentaires possibles. Complémentarité … de forme … de charge enzyme + - - + + + - - WINNER Looser! PLAN 7

1.2 1. Mécanisme de catalyse. 1.2. Relation enzyme / substrat. Glu 270 La bonne conformation du site permet la fixation du substrat. AA non collaborateurs ne jouent aucun rôle connu sur la conformation du site. Carboxypeptidase A 3 classes d’acides aminés participent à la conformation du site de reconnaissance. Site de reconnaissance Glu 270 AA de contacts créent les liaisons avec le substrat La protéine change de conformation pour permettre la catalyse. AA auxiliaires positionnent les AA de contact et forment la structure du site. Tyr 248 AA collaborateurs AA de la protéines ne faisant pas parti du site mais dont la position influe sur celles des auxiliaires. La carboxypeptidase A reconnaît le résidu C terminal d’une protéine possédant un noyau aromatique (ou une chaîne volumineuse) Arg 145 PLAN 8

Modèle d’adaptation induite 1. Mécanisme de catalyse. 1.2. Relation enzyme / substrat. La fixation du substrat s’accompagne d’un changement de conformation du site qui permet la bonne orientation des groupes catalytique du site actif. Hexokinase glucose Site catalytique Modèle d’adaptation induite (Koshland) 1.2 12/11/2014 On dirait la sonde Philae larguée par Rosetta sur la comète… Changement de conformation PLAN 9

Mauvaise reconnaissance. 2. Les paramètres enzymatiques. La reconnaissance du substrat intervient dans la vitesse de la réaction. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.1. Reconnaissance du Substrat. 2.1.1 Enzyme Substrat Bonne reconnaissance. Mauvaise reconnaissance. Y’a les bonnes enzymes et y’a les mauvaises enzymes… PLAN 10

La vitesse de catalyse intervient dans la vitesse de la réaction. 2. Les paramètres enzymatiques. La vitesse de catalyse intervient dans la vitesse de la réaction. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.2. Vitesse de catalyse. 2.1.2 Enzyme Substrat Bonne catalyse. Mauvaise catalyse. Tu vois, la bonne enzymes, elle voit le substrat… PLAN 11

2.1.3 2. Les paramètres enzymatiques. La concentration intervient dans la vitesse de la réaction. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.3. Concentration en substrat. 2.1.3 Enzyme Substrat Substrat concentré. Substrat peu concentré. Super important la concentration… PLAN 12

2.2.1 + exo1 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.1 + exo1 Tracer la cinétique. Commenter son allure. 2.2.1. Cinétique enzymatique. On a vu que la concentration en substrat influence la vitesse de la réaction. Pourquoi cette inflexion ? Au fur et à mesure du déroulement de la réaction, la concentration en substrat baisse. t en mn C en µmol.L-1 0,0 0,5 2,1 1 4,3 1,5 6,4 2 8,6 2,5 10,2 3 11,6 3,5 12,5 4 13,4 Elle s’infléchit. La courbe part de zéro. PLAN 13

2.2.1 2. Les paramètres enzymatiques. Calculer la vitesse de la réaction à t = 0. Quelle est la méthode employée ? 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.1 2.2.1. Cinétique enzymatique. On mesure la pente de la tangente. Pour les mathématiciens: Pente = dy / dx C’est la dérivée Que remarque-t-on ? La pente de la tangente est également la pente de la droite qui passe par zéro. Pour les physiciens: Pente = Dy / Dx Pour les biologistes, on verra que c’est encore plus simple. Pente = (14 - 0) / (3,3 - 0) = 4,24 µmol.l-1.mn-1 Comme la droite passe par zéro, la pente devient le rapport des coordonnées d’un point de celle-ci. Pente = 14 / 3,3 = 4,24 µmol.l-1.mn-1 Pour les biologistes: Pente = y / x PLAN 14

C’est le principe de la méthode à deux points ! 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. Calculer la vitesse moyenne entre 0 et 4 mn 2.2.1 2.2.1. Cinétique enzymatique. Calculer la vitesse moyenne entre 0 et 2 mn Que remarque-t-on ? La vitesse moyenne correspond à la vitesse à l’origine si l’on reste dans le domaine le linéarité. En enzymo, on se place toujours dans les conditions expérimentales qui correspondent au domaine de linéarité du graphe. V 0-4 = 13,16 / 4 = 3,3 µmol.l-1.mn-1 C’est le principe de la méthode à deux points ! V 0-4 = 8,5 / 2 = 4,25 µmol.l-1.mn-1 PLAN 15

2.2.2 + exo2 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.2 + exo2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Les enzymologistes caractérisent l’efficacité d’une enzyme en fonction de l’effet de la concentration en substrat. C’est pourquoi, l’étude enzymatique débute par la mesure des vitesses initiales des réactions à différentes concentrations. Leonor Michaelis (Berlin, 16 janvier 1875 - New York, 8 octobre 1949) est un biochimiste et médecin allemand, renommé pour son travail avec Maud Menten sur la cinétique enzymatique et l'équation de Michaelis-Menten, proposée en 1913. Wikipédia PLAN 16

2.2,2 2. Les paramètres enzymatiques. Tracer les cinétiques: C = f ( t ) 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. So en µmol.L-1 t en mn 0,5 1 1,5 2 4 5 0,0 2,1 3,3 4,1 4,6 5,7 6,0 4,3 6,7 8,2 9,2 11,4 12,0 6,4 10,0 12,3 13,8 17,1 18,0 8,6 13,3 16,4 18,5 22,9 24,0 2,5 10,2 15,8 19,4 21,9 28,6 30,0 3 11,6 22,1 24,9 33,6 35,3 3,5 12,5 23,8 26,8 37,2 39,1 13,4 20,8 25,5 28,8 40,2 42,2 C en µmol.L-1

2.2,2 2. Les paramètres enzymatiques. Tracer les cinétiques: C = f ( t ) 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. So en µmol.L-1 t en mn 0,5 1 1,5 2 4 5 0,0 2,1 3,3 4,1 4,6 5,7 6,0 4,3 6,7 8,2 9,2 11,4 12,0 6,4 10,0 12,3 13,8 17,1 18,0 8,6 13,3 16,4 18,5 22,9 24,0 2,5 10,2 15,8 19,4 21,9 28,6 30,0 3 11,6 22,1 24,9 33,6 35,3 3,5 12,5 23,8 26,8 37,2 39,1 13,4 20,8 25,5 28,8 40,2 42,2 C en µmol.L-1 Ci Vi en mmol.L-1 en µmol.L-1.mn-1 0,5 4,3 1,0 6,7 1,5 8,2 2,0 9,2 4,0 11,4 5,0 12

2.2,2 2. Les paramètres enzymatiques. Tracer le graphe: Vi = f ( Ci ) 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Commenter l’allure du graphe. La vitesse de la réaction augmente avec la concentration en substrat. Si C = infinie, la vitesse est maximale. Ci Vi en mmol.L-1 en µmol.L-1.mn-1 0,5 4,3 1,0 6,7 1,5 8,2 2,0 9,2 4,0 11,4 5,0 12 Vi en µmol.L-1.mn-1 …jusqu’à atteindre un palier. La pente diminue progressivement… Si C = 0, la vitesse est nulle. C’est logique ! PLAN 19

2.2,2 2. Les paramètres enzymatiques. Il s’agit de la représentation de Michaelis 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Le calcul des paramètres Vm = valeur de l’asymptote Plus Vm est grand, plus l’enzyme est efficace. Vi en µmol.L-1.mn-1 Vm Premier paramètre = Vm Second paramètre = Km Km = valeur de concentration pour laquelle V = ½ Vm Vi/2 Km PLAN 20

2.2,2 2. Les paramètres enzymatiques. Tracer les cinétiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Déterminer les Vi. Tracer la représentation de Michaelis. C mmol 10 20 40 80 100 140 t s 0,0 2 4,4 7,7 12,2 17,4 19,0 21,2 5 11,0 19,2 30,6 43,5 47,5 53,0 22,1 38,5 61,2 87,0 94,9 106,1 15 33,1 57,7 91,8 130,4 142,4 159,1 44,1 76,9 115,0 160,0 170,0 200,0 30 62,0 100,0 140,0 210,0 230,0 250,0 50 80,0 120,0 180,0 280,0 300,0 C mmol 10 20 40 80 100 140 t s 0,0 2 4,4 7,7 12,2 17,4 19,0 21,2 5 11,0 19,2 30,6 43,5 47,5 53,0 22,1 38,5 61,2 87,0 94,9 106,1 15 33,1 57,7 91,8 130,4 142,4 159,1 44,1 76,9 115,0 160,0 170,0 200,0 30 62,0 100,0 140,0 210,0 230,0 250,0 50 80,0 120,0 180,0 280,0 300,0 en µmol C Vi 0,0 10 2,2 20 3,8 40 6,1 80 8,7 100 9,5 140 10,6 PLAN 21

2.2,2 2. Les paramètres enzymatiques. Tracer les cinétiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Déterminer les Vi. Tracer la représentation de Michaelis. Vm Calculer Vm et Km. C Vi 0,0 10 2,2 20 3,8 40 6,1 80 8,7 100 9,5 140 10,6 Vm = 12 µmol.s-1 Vm / 2 Km = 40 mmol Km PLAN 22

Il s’agit de la représentation en double inverse 2. Les paramètres enzymatiques. Tracer le graphe: 1/V = f ( 1 / C ). 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Il s’agit de la représentation en double inverse Ou Lineweaver et Burk. C Vi 1/C 1/Vi 0,0   10 2,2 0,100 0,45 20 3,8 0,050 0,26 40 6,1 0,025 0,16 80 8,7 0,013 0,12 100 9,5 0,010 0,11 140 10,6 0,007 0,09 C Vi 0,0 10 2,2 20 3,8 40 6,1 80 8,7 100 9,5 140 10,6 PLAN 23

2.2,3 2. Les paramètres enzymatiques. Méthodes de calculs des paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,3 2.2.3. Représentation de Lineweaver et Burk. Méthode graphique Méthode informatique On utilise l’équation de la droite de tendance. Ci = infini ---> 1/Ci = 0 y = 3,87.x + 0,067 Vm = 1 / 0,067 = 15 µmol.s-1 Vm = 1 / 0,067 = 15 µmol.s-1 Vm = 1/b 2/ Vm Km = 1 / 0,017 = 58 mmol. Km = 3,87 / 0,067 = 58 mmol.L-1 Vm = 1 / 0,066 = 15 µmol.L-1mn-1 Km = a/b 1/ Vm 1/Km PLAN 24

des paramètres enzymatiques. Il existe une autre façon de mesurer Km 2. Les paramètres enzymatiques. Méthodes de calculs des paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2,3 2.2.3. Représentation de Lineweaver et Burk. Il existe une autre façon de mesurer Km Personnellement, je trouve que c’est une méthode qui présente plus d’inconvénients qu’autre chose… y = 3,87.x + 0,067 Il existe d’autres représentations. Lineweaver et Burk est la moins précise de toutes. Mais elle est la plus pratique visuellement. Alors, on la garde quand même. 1/ Vm - 1/Km PLAN 25

2.3.3.5 Eisenthal 2. Les paramètres enzymatiques. Cette méthode consiste à tracer un réseau de droites à partir des couples de valeurs expérimentales ([S], Vi). 2.2. Détermination des paramètres. 2.3.3.5 Eisenthal 2.2.4. Pour le plaisir: Eisenthal et Cornish-Bowden. point 1: (x = -S, y = 0) point 2 : (x = 0, y = Vi) Il s’agit d’un traitement statistique des résultats obtenus. 7 droites donnent 13 intersections correspondant à 13 Vm et 13 Km. Les valeurs (Vm ou Km) correspondent aux valeurs médianes obtenues. S V 0,0 10 2,2 20 3,8 40 6,1 80 8,7 100 9,5 140 10,6 Vm = 15 µmol.s-1 Km = 58 mmol.L-1

2.2.4 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.4 2.2.4. Les unités. Vm caractéristique de potentiel catalytique de l'enzyme: plus Vm est grand, plus l'enzyme est efficace. vitesse de catalyse (kcat): nombre de molécules de substrat transformées par seconde. Unité enzymatique (UE): µmoles de molécules de substrat transformées par minute. Il existe des unités dérivées. Unité enzymatique par volume de solution (UE.ml-1): UE / volume de solution Activité spécifique (UE.mg-1): UE / masse de protéine PLAN 26

3 3. Les iso-enzymes. PLAN 27 M4 M3H M2H2 MH3 H4 Ce sont des enzymes de structures différentes qui catalysent la même réaction. PLAN 27 3 Lactate déshydrogénase LDH Pyruvate Lactate La LDH est un tétramère de sous unités de 35 kD. Il existe deux types de chaînes appelées M et H qui peuvent former cinq types de tétramères. M4 M3H M2H2 MH3 H4

Lactate déshydrogénase 3. Les iso-enzymes. PLAN 28 Si elles sont différentes, c’est qu’elles ne sont pas pareilles ! 3 Km µmol.L-1 H4 300 MH3 220 M2H2 155 M3H 90 M4 30 Pyruvate Lactate Lactate déshydrogénase LDH WINNER M2H2 M4 M3H MH3 H4 Vm mol.s-1 1000