ADN fœtal dans le sang maternel > J.M. COSTA Laboratoire Cerba Colloque ATC Aix-en-Provence 20 Septembre 2010

Diagnostic prénatal in utero en France : rappels Principales indications Anomalies chromosomiques 94.375 Maladies et caractéristiques génétiques 2.881 Mucoviscidose Hémoglobinopathies Amyotrophie spinale Achondroplasie… Foetopathies infectieuses 6.443 Toxoplasmose Cytomégalovirus, parvovirus B19, varicelle… Données Agence de la Biomédecine année 2007

Diagnostic prénatal in utero en France : rappels Diagnostic des anomalies chromosomiques : 94.375 Indication Age maternel ( 38 ans) 30.677 Marqueurs sériques 38.377 Soit de 345 à 690 pertes fœtales pour 895 trisomies 21 détectées Données Agence de la Biomédecine année 2007

Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Les acides nucléiques circulants ou cellules fœtales ?

ADN fœtal plasmatique Physiopathologie Origine cellulaire: les cellules trophoblastiques Apparition précoce dans la circulation maternelle ≈ 5-6SA Augmentation de la concentration tout au long de la grossesse Disparition rapide (< 48 h) après accouchement (1/2 vie 16 min) Pas de persistance après grossesse

ADN fœtal plasmatique    Méthode d’étude de concept simple Recueil du plasma/sérum Extraction des acides nucléiques Analyse par biologie moléculaire   

ADN fœtal plasmatique  Difficultés et limites Analyse moléculaire Séquençage… MLPA, QF-PCR… Caryotype moléculaire (CGH-array, SNP-array) 

ADN fœtal plasmatique  Difficultés et limites d’analyse Ne représente que 3 à 6% de l’ADN plasmatique Quantité faible au 1er trimestre : 20-30 Geq/ml Analyse restreinte à la détection de séquences absentes du génome maternel 

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel Y X Détermination du sexe fœtal : Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gèneSRY)

Diagnostic de sexe fœtal par analyse de l’ADN fœtal circulant Sérum positif (x4) Sérum négatif (x4) Dear Diana, Thank you so much for your kind invitation to present the work of our group on circulating fetal dna in maternal serum

Détermination du sexe foetal Intérêts Maladies génétiques liées à l’X Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque) Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase) Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile) Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie Aide à la prise en charge.

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel RHD+ RHD- Génotypage RHD fœtal : séquences dérivées du gène RHD

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du système rhésus 3’UTR Gène RHD Gène RHCE 98 % d’homologie au niveau nucléotidique 92 % d’homologie au niveau protéique

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif + 42 % + Phénotype RhD-positif 85 % + 43 % del del Phénotype RhD-négatif 15 % del

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD Génome paternel RhD-positif Ex5 Ex7 Ex10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-positif Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-négatif

Génotypage RHD fœtal non invasif Indications Les patientes RhD-négatives allo-immunisées Eviter un geste invasif qui risque de réactiver l’immunisation Les patientes RhD-négatives devant subir un geste invasif Eviter une prophylaxie anti-D inutile Mise en place d’une prophylaxie immédiate Intérêt: environ 30% des fœtus sont RhD-négatifs Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités) Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111:8982-902). Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter: 278 femmes en l’absence de génotypage 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques (ou caractéristique génétique)? Un défi technologique majeur-1 Délétion/insertion, réarrangement complexe and expansion de triplets : IMPOSSIBLE (?) Détection de mutation ponctuelle: ENVISAGEABLE … si développement de techniques sensible de détection de séquences minoritaires Real-time PCR (PNA, allele-specific…) PCR-dHPLC PCR-High Resolution Melting PCR et primer extension (MALDI-TOF)…. The question now, is : Can we do more especially regarding single gene disorders and chromosomal abnormalities? Challenges are different in these both areas. For single gene disorders, it will be probably not possible to develop an assay for large deletion rearrangements or large triplet repeats expansion. On the other side, detection of single base mutation detection should be achievable by using highly sensitive methods like these.

Détection d’une population minoritaire d’allèle muté: exemple de la PCR-HRM Proportion de l’allèle muté au sein d’un background « sauvage » 5% 2.5% 1% 0% Let me show you on this slide for exemple that amounts as low as 1or 2% of a mutated allele in a wild type background can be easily detected by using some new technlogies like high resolution melting.

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus Mutation de novo : achondroplasie Recherche de la mutation G380R du gène FGFR3 Ce qui va changer ? (validation clinique en cours) Complément à l’analyse échographique Ce qui pourrait se faire ? Hypochondroplasie Nanisme thanatophore Syndrome d’Apert

Analyse de l’ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus K1 K2 SNP paternel : génotypage KEL (K1) Recherche du variant Thr193Met du gène KEL Ce qui va changer ? (validation clinique en cours) Plus de recours à l’amniocentèse chez les patientes allo-immunisées pour évaluation fœtale Ce qui pourrait se faire ? Génotypage plaquettaire (HPA1…) Diagnostic des maladies autosomiques dominantes (paternelle) Test de paternité

Diagnostic prénatal non invasif des anomalies chromosomiques (trisomie 21)? Un défi technologique majeur-2 Remaniements chromosomiques complexes: IMPOSSIBLE (?) Aneuploïdies (trisomie 13, 18 et/ou 21) : POSSIBLE … par quantification du nombre de chromosomes du fœtus : Marqueurs non spécifiques Marqueurs spécifiques du foetus: ARN (fœtaux) placentaires ou marqueurs épigénétiques Coming now to chromosomal disorders, especially trisomy 21. This is the most existing technologic challenge at the moment as dosage of chromosome in the fetal genome cannot be determined because it is cell-free and because of the high maternal background. To overcome this issue, two strategies have been imagine

ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification de marqueurs NON-SPECIFIQUES Chr21 mère Chr21 foetus The first one is based on quantification of non specific targets in order to evaluate this tiny over-representation of sequences derived from chromosome (of interest) 21 if the fetus is affected by Down syndrome for example. Such approach, requires an extraordinory high analytical precision that could be achieved by increasing dramatically the number of measurements. Foetus Euploïde Foetus T21

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Dosage chromosomique relatif (RCD) par Digital PCR

ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification par « massively parallel sequencing » reads chromosomes “bridge amplification” “by synthesis” Next generation sequencing is a potential tool in that situation. The rationale of next generation sequencing, whathever the platform, is not to determine a nucleotide sequence analysis but to use this technology as a counting method of single molecules by generating millions of reads. Each of these reads were aligned to the reference human genome and statistical comparaison with an euploid control group was then performed. Here is illustrated an over representation of sequences derived from chromosome 21 after calculation. “PCR emulsion” “by ligation” Single molecule amplification Massive parallel sequencing

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par « massively parallel sequencing » 18 patientes (terme médian: 18 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. 15 patientes (terme médian: 14 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par « massively parallel sequencing » Avantages Démonstration pour la détection des trisomies 13, 18 et 21 Approche indépendante de polymorphismes Inconvénients Coût et quantité de données générées (stockage) En l’état actuel, formats inadaptés à un haut débit Next generationsequencing offers some advantages -being able de detect other trisomies and being in a polymorphism independent approach, thus that could be used in all pregnancies. However, it would probably never become feasible in the current forms mainly because of high costs induced and because of its inability to be used in the required high throughput format.

ADN/ARN fœtal plasmatique et trisomie Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ARNs placentaires Chr21 Foetus euploïde Foetus T21

ARN fœtal circulant et trisomie Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs MassARRAY® (Maldi-Tof) A CGGGATAAATATCGACTC 5866.8 Da T C CGGGATAAATATCGACTC 6035.0 Da C CGGGATAAATATCGACTC 5762.8 Da CGGGATAAATATCGACTC 5359.6 Da

ARN fœtal circulant et trisomie Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs 57 patientes fœtus à caryotype normal (mean gestation 13.0 weeks) 10 patientes fœtus trisomie 21 (mean gestation 14.7 weeks) Ratio Sensibilité: 90 % (valeur prédictive négative 96,5 %)

ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ADN hyperméthylé Chr21 ChrRef Foetus euploïde Foetus T21

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par dosage chromosomique relatif Ratio de HLCS /ZFY ADNs hyperméthylés 29 patientes (1er, 2nd and 3ème trimestre) Tous les cas (5) correctement identifiés Finally an alternative approach based on relative quantification of methylated DNA markers seems to be very attractive as universal (i mean polymorphism independent) as recently proposed by Dennis Lo’s group. The assay is based on detection of methylated sequences derived from HLCS promotor gene located on chromosome 21. It could be the winner strategy. All cases were correctly diagnosed again in this small proof of concept study BUT with a technology as simple as real-time PCR allowing high troughput possibilties, lowest costs than NGS, making this approach compatible with a clinical routine test. In conclusion, I hope that your are convinced that the time is very exiting for non invasive prenatal diagnosis research. New tools are coming and they have potential to bring a new step toward clinical use of cell-free fetal nucleic acids Thank you very much for your attention.

Aspects règlementaires L’analyse de l’ADN fœtal circulant est un acte de diagnostic prénatal Laboratoires : Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH Praticiens : Agrément par l’Agence de la Biomédecine Déclaration annuelle des activités diagnostiques