Atelier Haute Fréquence, 22-23 octobre 2009 (Wimereux) Nouvelle méthode de monitoring in situ du phytoplancton : Analyse automatisée, à haute fréquence et à l’échelle individuelle des cellules M. Thyssen, G.Grégori, A. Malkassian & M. Denis Laboratoire LMGEM, Centre d’Océanologie de Marseille (OSU) Université de la Méditerranée Campus de Luminy, Marseille gerald.gregori@univmed.fr

Importance des microorganismes marins Le phytoplancton: Principal producteur de matière organique Phytoplancton = premier élément du réseau trophique (entrée du C dans le réseau) Cycles rapides (jusqu’à plusieurs divisions par jour) Sensibilité aux variations environnementales biotiques (prédation, lyse virale) et abiotiques (hydrologie, vent) Réponse plus rapide à ces changements - Groupe polyphylétique très diversifié (>15 000 espèces) - Principalement des organismes photosynthétiques unicellulaires (<1 à ~ 2 000 µm) - Flottent dans la couche euphotique ~2 % de la biomasse photosynthetique sur Terre ~45 % de la production primaire globale (Field et al., 1998)

Flux biogéochimiques : fonction de la structure de la communauté

Prise de conscience du rôle des microorganismes www.soes.soton.ac.uk www.jochemnet.de

Toxicité de certaines espèces © European Communities, 1995-2003

Le problème de l’échantillonnage Neither qualitative nor quantitative surveys generally sample the phytoplankton adequately (Smayda, 1998, Baretta et al., 1998) Nécessité d’un suivi des populations Compréhension de leurs dynamiques à des échelles de temps et d’espace adéquates.  Approche par analyse individuelle et haute fréquence temporelle

Méthodologie pour étudier le phytoplancton à l’échelle individuelle des cellules (méthode non destructrice) Analyse traditionnelle Analyse par cytométrie en flux Echantillonnage

Principe de la cytométrie en flux particules en suspension flux monodisperse interception par un faisceau laser. La diffusion de la lumière et les émissions de fluorescence sont collectées, filtrées et converties en valeurs digitales enregistrées sur un PC. Fluidique Optique Electronique

Analyse du phytoplancton (taille <10 micron) picoeucaryotes Synechococcus Billes de calibrage Prochlorococcus picoeucaryotes nanoeucaryotes 6-10 microns 3-6 microns Fluo. rouge (ua) Synechococcus Diffusion 90°(ua) Fluo. verte (ua) Analyse ataxonomique

Pourquoi la cytométrie en flux devient populaire chez les microbiologistes? Analyses rapides (plusieurs dizaines de milliers de cellules analysées par seconde)  Permet d’analyser un grand nombre de cellules  Résultats statistiques robustes et représentatifs Analyse multiparamétrique à l’échelle individuelle Données quantitatives (corrélation avec d’autres données biochimiques) Mesures en temps réel Classes de taille et abondance cellulaire Marqueurs uniques: - naturels (chlorophylle, autres pigments autofluorescents) - induits (coloration)  fluorochromes (sondes) Tri (post-analyses, cultures)

Plateforme régionale de cytométrie pour la microbiologie (PRéCyM) du COM (2005) Qu’est-ce qu’une plateforme? Centralisation d’équipements et d’un savoir faire à disposition des unités/instituts, des domaines public et privé, Exploitation technique, économique et scientifique optimale des appareils, - Développement et veille technologique, valorisation de la recherche, formation. Equipement 2 analyseurs (paillasse) 2 trieurs dont un embarquable 1 analyseur in situ <<< Plateforme animée par un comité de gestion (mise en place en 2005) >>> Contacts : michel.denis@univmed.fr et gerald.gregori@univmed.fr http://precym.com.univ-mrs.fr

Cytosub (Cytobuoy) : un cytomètre en flux dédié à l’analyse autonome et in situ du phytoplancton. Analyse in situ jusqu’à 200 m. de profondeur Fréquence d’échantillonnage maximale toute les 10 min. Durée d’immersion possible de plusieurs semaines

Variables mesurées par le Cytosub - Deux variables dites de diffusion des photons du laser : + Aux petits angles (FWS : forward scatter)  Taille des particules. + A 90° (SWS : sideward scatter) Morphologie de la cellule (forme, granularité, paroi cellulaire, composition interne,...). - Trois variables d’émission de fluorescence (autofluorescence): + Rouge centrée sur 734-668nm  carotène et chlorophylle a. + Orange centrée sur 601-668nm  phycobilines (spécifiques aux Cyanobactéries et Cryptophytes) + Jaune centrée sur 536-601nm  phycoérythrine. Profil des signaux le long des particules (signature optique du phytoplancton) Module de prise d’image (module Image in flow)

Acquisition de données Temps Fluide Faisceau Laser L’instrument enregistre les signaux des profils optiques dont voici le processus : La cellule arrive devant le faisceau laser de longueur d’onde de 488 nm, à une vitesse de 2 m/s, et l’instrument collecte les profils correspondant a la forme, le contenu et la positon relative des pigments. Ainsi, chaque cellule renvoie une image scannée de ses propriétés optiques. Chambre en Quartz Intensité du Signal Flux 14

Exemples de données

Exemples de données

Exemples de données sur des chaînes

De la particule détectée in situ à la cellule identifiée De l’échantillon naturel … …à la particule … … à la cellule Fluorescence rouge (ua) Taille (ua)

Travaux de thèse de Mélilotus THYSSEN Phytoplankton spatial and temporal high frequency analysis using automated and submersible flow cytometry Diversité du phytoplancton étudiée cellule par cellule sur la base de leurs propriétés optiques (diffusion, fluorescence) Fluorescence rouge (u.a.) Type cellulaire 1 Type cellulaire 2 Type cellulaire 3 Diffusion (u.a.) En effet, la prise en compte de la diversité des acteurs de la pompe biologiques est un volet nécessaire pour estimer les fonctions de chaque organismes au sein des processus biogéochimiques. Dans le cadre de mes travaux, elle est prise en compte par l’analyse individuelle des cellules sur la base de leur caractéristiques optiques de diffusion et de fluorescence. C’est un cytometre en flux qui analyse les cellules une par une. L’outil que j’ai utilisé, et ceci pour la première fois en France, a été conçu pour l’analyse automatisée et in situ du phytoplancton. Il enregistre le profil des signaux généré par les cellules. Et voici un exemple d’un échantillon prélevé en zone côtière méditerranéenne qui montre 3 types cellulaires de forme et de taille différentes dans le même echantillon. L’analyse in situ évite les modifications du système étudié,ce qui est souvent le cas lorsque les échantillons doivent être stockés pour des analyses antérieures. L’analyse a l’échelle de l’individu permet d’observer la diversité et la physiologie , liée a leur activité métabolique.  Analyse in situ = pas de modifications du système étudié Analyse individuelle des cellules = diversité et physiologie Diversité des types cellulaires est variable en fonction des conditions environnementales  Notion de groupe fonctionnel de réponse Thyssen et al., 2008a, J. Plank. Res.

Exemple de deux types phytoplanctoniques Travaux de thèse 2/ L’hétérogénéité temporelle Point fixe côtier Méditerranée. Fréquence d’analyse 30 min. Données in situ. Exemple de deux types phytoplanctoniques 40 14 000 échantillons! Hétérogénéité en fonction: - du régime de vent, - du rapport N/P 30 103 cells.cm-3 20 10 Si échantillonnage classique: sur ou sous estimation de la variation de la biomasse Biomasse globale (fluorimétrie) Sur- sous estimation liées aux facteurs de conversion C/Chl Jours 02 07 12 6 40 5 30 4 17 h µg chl a.dm3 3 103 cells.cm-3 J’ai ensuite utilisée cette nouvelle approche pour rendre compte de l’hétérogénéité temporelle de la distribution du phytoplancton lors d’un suivit estival en un point fixe côtier et en programmant des analyses in situ toutes les demi heures. Voici un exemple de la variabilité de l’abondance de deux types de cellules. Lors d’un échantillonnage classique d’un prélèvement par jour soit a 8h du matin soit a 17 h du soir, les écarts avec les estimations de production de biomasse journalière peuvent être de plus de 50%. De même, l’utilisation de la biomasse globale obtenue par fluorimétrie par apport a une estimation par type cellulaire, ne permet par de rendre compte de l’hétérogénéité intra groupe de cette biomasse. Cette nouvelle approche découple la biomasse en fonction des groupes cellulaires et permet une estimation réaliste de la variation de la biomasse et donc des flux de matière. 20 2 10 8 h 1 Jours 02 07 12 02 07 12 Jours L’observation à haute fréquence donne une estimation réaliste de la variation de leur biomasse, donc des flux de matière Thyssen et al. 2008b, J. Plankt. Res.

Travaux de thèse 3/ L’hétérogénéité spatiale Projet ACYPHAR - radiale Açores - Lorient, Atl. Nord Est. Résolution ~2 km. Prélèvement automatisé des eaux de surface par cytométrie en flux Ex. de deux types phytoplanctoniques Chlorophylle de surface par téledétection  Déconvolution entre cause interne (cycle cellulaire) ou externe (hydrodynamisme) de la variation des abondances En utilisant le même équipement, j’ai étudié l’hétérogénéité spatiale de la distribution du phytoplancton par des analyses a haute fréquence entre les acores et Lorient en atlantique nord est. La résolution spatiale était de 2 km, ce qui était une première sur une telle distance. Les données obtenues à l’aide de la cytométrie en flux ont mis en évidences 7 groupes aux caractéristiques de taille et de formes différentes. Voici l’exemple de la dynamique de l’abondance de deux groupes comparées aux données modélisées de la chlorophylle de surface (Modis-ifremer). Les résultats ont montré qu’il était possible de déconvoluer les variations d’abondances liées aux cause internes, c’est-à-dire aux cycles cellulaires de celles liées aux cause externes, c’est-à-dire de l’hydrodynamisme et de l’hydrologie. La résolution de l’échantillonnage permettra un ajustement des algorithmes de calcul de la biomasse autotrophe a partir des images satellites dont la résolution est du même ordre de grandeur. Les contacts avec les chercheurs spécialisés dans le domaine de la télédétection devraient permettre cette approche.  ajustement des algorithmes de calcul de la biomasse autotrophe á partir des images satellites avec des données in situ de même résolution (1-2 km) Thyssen et al. 2008, Biogeosciences Thyssen et al. 2005, J. Geophy. Res. Denis & Thyssen 2007. Quand océanologie et réinsertion sociale se concertent. Journal de l’INSU

Production Nette = Δ Biomasse / Δt Travaux de thèse 4/ Détermination de la production communautaire nette Pour chaque type cellulaire et grâce à l’observation à haute fréquence Taux journalier de croissance et de décroissance apparente 40 30 Abondance (Biomasse) 103 cells.cm-3 20 10 Temps t L’observation a haute fréquence des variations d’abondances permet de définir un taux journalier de croissance apparente, et de la même façon, permet de définir une taux journalier de perte apparente. Cela conduit a une estimation de la production nette, qui peut être définie par une variation de la biomasse au cours du temps. Ce mode de détermination de la production nette est obtenue uniquement grâce a l’observation a haute fréquence des groupes cellulaires. Cette nouvelle stratégie permet de rendre compte de la quantité de matière qui transite à travers chaque type de cellule, et donc d’estimer de manière adéquate la variation des stocks de matière particulaire biogène ce qui aboutira a un ajustement des flux de matière au sein de la pompe biologique. 02 07 12 Production Nette = Δ Biomasse / Δt Détermination de la production nette grâce à la haute fréquence  Estimation adéquate de la variation des stocks de matière particulaire biogène

Nouvelle thèse sur l’Etang marin de Berre - Un des plus grands étangs marins de Méditerranée. - Proche de l’agglomération Marseillaise, - Soumis à de fortes pressions d’origine anthropique (rejets d’eau douce de la centrale EDF, activités industrielles, forte population sur son bassin versant, etc.).  Très fort intérêt pour la Région Particularités : Forte stratification haline Arrivées soudaines et massives d’eau douce (Centrale EDF) Vent (Mistral)  homogénéisation Episodes d’eutrophie (anoxie) (Figures David Nérini)

Etang sous haute surveillance Carte bathymétrique de l'Etang de Berre + Hydrologie : -Température, - Salinité, - Turbidité, - Oxygène Dissous Données horaires 5 niveaux de la colonne d’eau + Courantologie (XSurvey) + Chimie (Sels nutritifs…) + Météorologie + Biologie : - « gros » phytoplancton - algues et phanérogames - zooplancton - poissons Et les micro-organismes dans tout ça? Station automatique de prélèvements

Automatisation du traitement des données issues du Cytosub Problème : Discriminer des groupes sur la base de leur signature optique. Hypothèse : Information discriminante dans la forme que prennent les profils. (Malkassian et al. En préparation)

Pourquoi ce sujet ? [Intérêt scientifique] Description (Qui est là? Et quand?): Caractériser spatialement et temporellement les composantes de l’assemblage microbien en relation avec l’environnement biotique et abiotique - d’après leurs propriétés optiques de diffusion et de fluorescence, par analyse d’image (automatisée). Etudier les abondances avant, pendant et après les forçages : Vent (Mistral)  Rupture de la stratification haline Apport d’eau de mer (passe de Caronte)  Espèces marines Apport soudain et massif d’eau douce (Centrale hydroélectrique de Saint-Chamas)  Espèces dulçaquicoles Dynamique (Qui varie comment?) Réponse des assemblages microbiens aux changements environnementaux biotiques et abiotiques (notions de groupes fonctionnels) Modélisation

Conclusion  Cytométrie en flux autonome in situ: Permettra de réaliser un suivi à haute fréquence et à l’échelle individuelle des assemblages phytoplanctoniques. Analyse réalisée grâce a un instrument immergé autonome permet de s’affranchir de l’opérateur et des sorties en bateau dépendantes de la météorologie Ce système garantit des séries de données à haute fréquence, et continues (peu ou pas de données manquantes). Appréhender la dynamique de l’écosystème suite à une perturbation soudaine (fort vent, apport massif d’eau douce, rupture de la stratification haline, etc.) Répondre aux questions posées (cas de l’Etang de Berre par exemple) ----------------------------------------------------------------------------------------------- - Finalité de l’approche : le domaine marin côtier et ouvert (stations fixes et navires d’opportunité (Méthaniers? Ferries? Portes-conteneurs?) - Etendre l’approche aux « bactéries » (AO INSU-CSOA & CETSM) Observation = Constitution d’une base de données unique sur le phytoplancton en Mer Méditerranée

L’équipe Michel DENIS (DR émérite CNRS) Mélilotus THYSSEN (Post-doctorante) Anthony MALKASSIAN (Doctorant 2009) Zhao LI (Doctorante 2009) Ainsi que : Aude BARANI (plate-forme PRECYM) Beatriz BECKER (identification du phytoplanton) Nicole GARCIA (analyses sels nutritifs) David NERINI (MCF, Statistiques) Patrick RAIMBAULT (SO du COM)