L’interférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie Odile.Filhol.Cochet@cea.fr INSERM EMI 104 CEA Grenoble

Comparaison entre différentes méthodes d’inhibition de gènes. ---------------------------------------------------------------------- Méthodes Avantages Inconvénients Knock-out animal Inhibition Complète du gène Laborieux, cher, Des mutants létaux peuvent empêcher le développement embryonnaire Petites molécules introduction facile Spécificité variable inhibitrices Travail de développement intensif Anti-sense DNA Facile Efficacité variable peu onéreux Spécificité variable Nécessite une transfection RNA interference Spécifique Knock-down (pas knock-out) Relativement facile Nécessite une transfection

Hybridation AS+ARN puis degradation: Antisens (ssDNA): un autre mécanisme pour le blocage de l’expression des gènes Hybridation AS+ARN puis degradation: 3 modes d’intervention des antisens dans la cellule: dégradation par la RNaseH arrêt de transcription régulation de la maturation des ARN (de: http://www.isispharm.com + Scherer et Nature 2003 21, p1457)

La RNAissance 1998, RNA interférence : inhibition post-transcriptionnelle de l’expression de gènes après introduction d’ARNdb (nématode) Fire et al. 2001: siRNA dans des cellules de mammifères Elbashir et al. En 2002, Science magazine élit les RNAi comme la plus grande avancée technologique de l’année 2003. 2004, association de la génomique fonctionnelle et du RNAi en oncologie (Oncogene)

L’ARNi: une nouvelle star biotechnologique Principe de l’interférence ARN: Spécificité de la dégradation RISC (RNA-induiced sillencing complex)

Origines de siRNA siRNA Prêt à agir après phosphorylation (synthèse chimique) RNAi (viral) shRNA (small hairpin) Produit à partir de plasmides miRNA (micro : in vivo) Découpés par DICER en siRNA

Mode d’action de l’interférence

Design de siRNA Critères d’efficacité: >90% de réduction du niveau de la protéine. [siRNA] de 1 à 20 nM Éviter les régions 3’ et 5’ non codantes du gène.

Choix d’une séquence siRNA Copier une séquence de 21 nt ayant les bons critères S’assurer que cette séquence est spécifique du gène à cibler (BLAST) Commander la séquence et son contrôle sous forme: - ARN synthétique - ADN NB:Il faut choisir au moins 3 siRNA pour cibler un gène.

Méthodes de production des siRNA. ------------------------------------------------------------------------- Méthodes de production des siRNA. Méthodes Avantages Inconvénients Synthèse Rapide RNAi Transitoire Chimique Nécessite une transfection Chimique: grande purité Chimique: cher DNA (vecteur ou casette) moins cher Très laborieux RNAi stable possible Nécessite une transfection Vecteur viral RNAi stable Très laborieux Utilisable pour des cellules Potentiellement dangereux résistantes aux transfections par dsRNA/plasmides

Comment introduire le siRNA dans une cellule de mammifère? Par transfection de l’ARN ou de l’ADN (différents agents lipophiles) Par électroporation Par infection virale (adenoV*; retroV; lentiV) Comment introduire le siRNA dans un animal? Par électroporation par injection intra péritonéale Par injection intraveineuse (apolipoprotéine B)

shRNA transgénique génération of knockdown pour des lignées ES ‘Transgenic RNA interference in ES cell-derived embryos recapitulates a genetic null phenotype’ (May 2003, 21, 5 pp 559 - 561), Nature: Kunath et al. Exemple: production stable de shRNA du gène p120-Ras GTPase-activating protein (RasGAP) Il est possible de concentrer sur un seul allèle: grand intérêt en génétique (dirigé contre une mutation dominante, exemple le gène Tau dans les troubles neurologiques)

Comment quantifier l’effet RNAi? Au niveau de l’ARNm Par Northern blot Par RT-PCR Au niveau de la protéine Par Western Blot Par immunofluorescence Par cytométrie en flux Par des tests phénotypiques ou fonctionnels

Applications Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue d’un gène connu). Combinaison de l’interférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir d’un phénotype connu).

Inhibition par RNAi de l’infection par HIV-1 de lymphocytes T humains Des recherches récentes par plusieurs groupes ont montré que l’interférence ARN était capable de diminuer la réplication de HIV-1 dans des lymphocytes en ciblant soient des gènes viraux (Tat, Gag et Rev) soient des gènes de la cellule hôte (CCR5 et CD4) . Approche combinatoire

Applications Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue d’un gène connu). Combinaison de l’interférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir d’un phénotype connu). Banques de siRNA.

Préparation d’une banque de siRNA

Le premier criblage RNAi Stanford's Pat Brown looking at RNAi in genomewide expression profiling PNAS's May 27 (2003) p1073. Depuis,quelques publications… La difficulté de créer de bonnes banques de siRNA, puis d’avoir un phénotype facile à mesurer sur des cellules cultivées et tranfectées au format de criblage à haut débit, explique la faible abondance de publications dans le domaine.

Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence Ciblage de molécules impliquées en carcinogenèse * voies d’oncogenèse (PTK, APC, PI3K HIF-1…) * Régulateurs du cycle cellulaire (RB, P53, cyclines…) * Apoptose (BCL2…) * sénescence (télomérase) * Stabilité et dégradation des protéines (cathépsine L)

Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence Ciblage de gènes impliqués dans les interactions hôte-tumeur Gènes importants pour l’angiogenèse (VEGF, angiogènine… Gènes importants pour la dégradation de la matrice extracellulaire (u-PA Gènes importants pour l’invasion et les métastases Gènes de l’adhésion cellulaire

Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence Ciblage de gènes important pour la résistance tumorale à la chimio et/ou radiothérapie Gènes MDR Molécules liées aux mécanismes de réparation de l’ADN ERCC1…

Biblio RNA interference collection Nature reviews Mai 2005 www.nature.com/reviews/focus/rnai Prospects of RNA interference therapy for cancer gene therapy 2006 0 1-13 www.nature.com/gt