Exemple de la Leucémie Lymphoïde Chronique Colloque ATC 2017 - LIMOGES Application du NGS à la recherche simultanée de mutations et d’anomalies cytogénétiques Exemple de la Leucémie Lymphoïde Chronique David Rizzo – CHU Limoges

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) Tableau d’hyperlymphocytose Immunophénotype spécifique : CD5+ CD23+ FMC7- CD79b et CD22 faible ou neg Expression faible de l’Ig de surface (IgM +/- IgD) CD45 faible Ombres de Gümprecht Dire age

Histoire naturelle de la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) Lymphocytose B monoclonale LLC de stade A LLC de stade B LLC de stade C (Classification de Binet) <5% par an Expansion progressive de lymphocytes clonaux  Variabilité d’évolution +++  facteurs biologiques déterminant l’histoire de la maladie Evolution MBL  LLC (oui) Annoncer : on va voir 2 facteurs bio la fragilité cellulaire et l’immunogénétique du BCR

2000 : modèle cytogénétique de Döhner 4 anomalies cytogénétiques récurrentes impliquées dans le pronostic del(17p) del(11q) +12 normal Adapté d’après Döhner et al. NEJM, 2000 del(13q) del(17p)  perte de p53 : Rce fludarabine del(11q)  perte d’ATM trisomie 12  ? del(13q)  perte miR15 et miR16.1

Intégration des anomalies cytogénétiques et des nouvelles mutations  Le modèle proposé par Rossi et al. (Blood 2013) Very low risk : del(13q) Low risk : caryotype normal, +12 Intermediate risk : del(11q) / SF3B1 / NOTCH1 Ce modèle marche sur notre série High risk : del(17p) / TP53 / BIRC3 Adapté d’après Rossi et al. Blood, 2013

Bilan génétique d’une LLC  del(13q) / +12 / del(11q) / del(17p) ? + +/- Cytogénétique caryotype QMPSF FISH Séquençage NGS (TP53+++) Biologie moléculaire + statut mutationnel IgHV

Intégration du NGS pour la détection de CNV  del(13q) / +12 / del(11q) / del(17p) ? + +/- Cytogénétique caryotype QMPSF FISH Séquençage NGS (TP53+++) Analyse de CNV par NGS Copy Number Variation (= gains ou pertes) Biologie moléculaire + statut mutationnel IgHV

Méthode 54 cas de LLC annotés en cytogénétique (i.e. caryotype + QMPSF +/- FISH) Séquençage NGS (Panel Ampliseq + Ion Proton) Analyse comparative CNV / cytogénétique Logiciel Cov’Cop (Copy Number Variation) +/- confirmation par Q-PCR

= SEQUENCAGE MASSIF PARALLELE Principe de base du NGS = SEQUENCAGE MASSIF PARALLELE Préparation des cibles à séquencer = LIBRAIRIE Cibles réparties sur une PUCE Séquençage de plusieurs MILLIONS de cibles EN MEME TEMPS !!!! Autant de séquences (READS) que d’espèces moléculaires chargées sur la puce Génération en quelques heures d’un grand nombre d’information  PIPELINE BIOINFORMATIQUE

Chaque ligne représente 1 séquence lue (=« read »)

Gains / pertes Liste des mutations Bioinformatique Liste des mutations Table des profondeurs de lecture pour chaque amplicon Gains / pertes

Cov’Cop : logiciel made in Limoges EA6309-GEIST, Université de Limoges : P. Derouault et A-S. Lia Téléchargeable gratuitement : https://git.unilim.fr/merilp02/CovCop.

Cov’Cop : logiciel made in Limoges « Biologiste-friendly » : pas besoin de compétences en bioinformatique Procédé de normalisation : Taille et richesse en GC des amplicons Taille de la librairie Sélection automatique des amplicons de référence Normalisation de type « Q-PCR » Pas besoin de contrôles normaux dans le run

Profondeurs de lecture Perte hétérozygote : ratio = 0.5 Normal : ratio = 1.0 Trisomie : ratio = 1.5 Ratio normalisés

Résultats

Choix d’un examen visuel des données Délétion BIRC3 et ATM Panel 62 gènes = 1200 lignes ! Délétion DLEU1 et DLEU2

Choix d’un examen visuel des données Délétion BIRC3 et ATM Délétion DLEU1 et DLEU2 Ratio normalisé  (échelle Log10) Délétion de BIRC3 et ATM  del(11q) Délétion de DLEU1 et DLEU2  del(13q) Amplicons rangés par ordre de position chromosomique 

Dispersion des ratios DM=0.05 DM=0.07 DM=0.09 DM=0.09 *DM = déviance de la médiane

Dispersion des ratios DM=0.05 DM=0.11 DM=0.07 DM=0.13 DM=0.09 DM=0.14 del(6q) ? DM=0.14 DM=0.09 DM=0.21 *DM = déviance de la médiane

Déviance de la médiane  Dispersion des ratios = 2 échantillons exclus de l’analyse DM=0.21 DM=0.05 Moyenne + 2 écart-types Déviance de la médiane  *DM = déviance de la médiane

Déviance de la médiane   Evaluer la qualité du run +++ Dispersion des ratios = 2 échantillons exclus de l’analyse DM=0.21 DM=0.05 Moyenne + 2 écart-types Déviance de la médiane   Evaluer la qualité du run +++ *DM = déviance de la médiane

Performances du NGS versus caryo/QMPSF/FISH

Performances du NGS versus caryo/QMPSF/FISH =22% 

Performances du NGS versus caryo/QMPSF/FISH Pas de faux positif par NGS =22% 

Performances du NGS versus caryo/QMPSF/FISH Diagnostiquée en FISH : 48/200 noyaux (24%), QMPSF-

Performances du NGS versus caryo/QMPSF/FISH Diagnostiquée en FISH : 48/200 noyaux (24%), QMPSF- Diagnostiquée en FISH : 35/200 noyaux (17.5%), QMPSF+

Performances du NGS versus caryo/QMPSF/FISH Diagnostiquée en FISH : 48/200 noyaux (24%), QMPSF- Diagnostiquée en FISH : 35/200 noyaux (17.5%), QMPSF+ Problème de normalisation clone del(13q) en %  Abondance

NGS et anomalies sous-clonales Faux négatifs NGS Vrais positifs évaluée sur le caryotype ou la FISH Abondance (%) du clone

NGS et anomalies sous-clonales Faux négatifs NGS Vrais positifs évaluée sur le caryotype ou la FISH Abondance (%) du clone Problème de normalisation pour le locus 13q14

NGS et anomalies sous-clonales Faux négatifs NGS Vrais positifs évaluée sur le caryotype ou la FISH Abondance (%) du clone Problème de normalisation pour le locus 13q14 Hypothèse de seuil de sensibilité = 25%

Vision plus large et plus précise des CNV Locus 13q14 del(13q) de type 2 : RB1 délété  Pronostic non favorable RB1 DLEU1/2 del(13q) de type 1 : RB1 préservé  Pronostic favorable

Vision plus large et plus précise des CNV Locus 13q14 del(13q) de type 2 : RB1 délété  Pronostic non favorable RB1 DLEU1/2 Amplification 2p  Pronostic défavorable Amplification de MYC  Pronostic défavorable del(13q) de type 1 : RB1 préservé  Pronostic favorable

Discussion

Points clés des CNV par NGS Facilité d’analyse de Cov’Cop  pas de compétences nécessaires en bioinformatique  anticipation lors de la phase de design du panel NGS Approche valide pour les 4 anomalies principales de la LLC  sensibilité = 25% de cellules tumorales porteuses de l’anomalie  optimisation nécessaire pour délétion 13q14 +++  remplace la QMPSF ! ….et la FISH ? Limitation : Cov’Cop dédié au tandem Ion Torrent / librairie par amplicon

Conclusion et perspectives Peut être déployée sur d’autres panels NGS (ex. panel myéloïde, ….) … développement d’une nouvelle version de Cov’Cop

REMERCIEMENTS EA6309-GEIST, Université de Limoges P. Derouault A-S. Lia Service d’histologie, Cytologie Cytogénétique et Biologie Cellulaire CHU Limoges S. Bourthoumieu Service d’Hématologie Biologique CHU Limoges L. Crowther J. Chauzeix MP. Laforêt N. Gachard J. Feuillard C. Soria A. Thibaut E. Rouzier V. Combeau M. Deveza V. Renat MC. Gironde A. Hacan Et tous les autres membres de l’équipe Développeurs de Cov’Cop