La PCR en temps réel Exemple d'utilisation au laboratoire de Bactériologie de l'hôpital Pellegrin Sabine Pereyre

PCR conventionnelle Dénaturation (95°C) 30 - 35 cycles ADN, amorces, dNTP, Taq pol Dénaturation (95°C) 30 - 35 cycles Hybridation des amorces Taq Elongation (72°C) Taq

PCR conventionnelle 1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2- Amplification 3- Révélation : Electrophorèse sur gel d'agarose (1-2%) Taq + - 3 temps dans 3 pièces différentes pour diminuer le risque de contamination Dépôt : à la cathode L'ADN s'ionise sur ses gpments phosphtes : négatif. Il migre vers l'anode

Cinétique de la PCR Pour une multiplication par 10 du nombre de copies, il faut 3,32 cycles. Chiffre à retenir!!

Cinétique de la PCR Phase plateau Phase exponentielle

PCR conventionnelle versus en temps réel PCR "classique" en point final PCR en temps réel Haute précision : en l'espace de quelques cycles, forte augmentation du nbr de cycles Haute précision pendant la phase exponentielle Variabilité importante à la phase plateau

PCR en temps réel Basée sur la détection d'un "reporter" fluorescent  Signal proportionnel à la quantité d'amplicons  Signal détecté "en temps réel" 1- Extraction (manuelle ou automatisée) 2- Amplification et détection synchronisée Système fermé, pas de manipulation post-amplification ● Rapidité ● Faible risque de contamination En temps réel = au fur et à mesure de sa génération Ampli et détection en 1 seul temps d’où gain de temps et moins de risue de contamination

PCR conventionnelle versus en temps réel Gel d'agarose PCR en temps réel Courbe de fluorescence Cette fois ci, ce n'est plus le nbr de copie mais la fluorescence (qui suit la même courbe que précédemment)

Seuil fixé au dessus du bruit de fond PCR en temps réel - Quantification Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité de produit amplifié  Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification Ct ( Cycle threshold) = nombre de cycle d'amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement significatif par rapport au bruit de fond (valeur seuil). Seuil fixé au dessus du bruit de fond Il existe une corrélation linéaire entre la valeur du Ct et le log du nombre de copies  Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré

Dérivée de la fluorescence Ct Autre représentation de la courbe de fluorescence: ici dérivée de la fluorescence. C'est une representation plus classiment utilisée. Nbre de cycles

Quantification – courbes de calibration Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 102 101 103 1 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Efficacité de la PCR E=10-1/s – 1 où s=pente de la droite de calibration Si 100%, un gain de 1 cycle dans l'acquisition du signal sera correlé à une quantité initiale de cible 2 fois supérieure. Plus l'efficacité diverge des 100%, plus l'interprétation des quantités relatives est difficile. La pente est l'indicateur de l'efficacité de la PCR. A 100% d'efficacité, elle sera = à -3.322 E dépend de l'efficacité de l'enzyme, de la qualité du thermocycleur, du prélèvement Cycle seuil - Ct Nombre de cycles Echantillon Inconnu : Ct =25

Génération de la fluorescence 1- Agent se liant à l'ADN double brin : ● STBR Green I 2- Utilisation de sondes ● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman ● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) ● Molecular Beacons (balises moléculaires)

Principe du SYBR Green I = Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente lorsqu'il est lié à l'ADN double brin hע Avant amplification SYBR Green hע F Après amplification ADN double brin Le SYBR Green se lie à l'ADN double brin par un mécanisme de liaison non défini Le SYBR Green en solution émet peu de fluorescence Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN double brin naissant, entraînant une augmentation de la fluorescence

Principe du SYBR Green I SYBR Green I Dye : liaison ADN double brin SYBR Green II Dye : Liaison ARN L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation (l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)

SYBR Green Avantage - Inconvénients - Economique - Facile d'utilisation - Pas d'expertise particulière pour le design de sondes fluorescentes - Non affecté par des mutations de l'ADN cible (qui affectent l'hybridation des sondes spécifiques) Inconvénients - La spécificité repose entièrement sur les amorces - Faux positifs, surestimation de la quantification (le SYBRgreen se fixe à n'importe quelle molécule d'ADN double brin y compris des produits non spécifiques ex : dimères d'amorces, mauvais appariements)  Analyse de la courbe de fusion indispensable

Analyse de la courbe de fusion - Chaque produit d'amplification est caractérisé par son Tm (température de fusion = melting temperature) = température pour laquelle 50% de l'ADN double brin est dissocié - Le Tm d'un produit d'amplification est mesuré en suivant l'évolution de la fluorescence lorsque la température augmente - Deux produits de PCR diffèrent par leur Tm  il est possible de détecter des produits non-spécifiques, des dimères d'amorce Après l'étape finale de PCR, les produits sont dissociés lentement et les données relatives à la fluorescence sont recueillies. Les résusltats sont exprimés grace aux dérivées des courbes de fusion représentées par des pics de fluorescence dont le positionnement sur l'axe des abvisses correspond au Tm Le Tm varie avec La composition en GC La taille du produit d'amplification Il est influencé par La concentration en sels (MgCl2) La concentration en SYBR Green I

Dérivée de la fluorescence Analyse de la courbe de fusion Dérivée de la fluorescence Température °C Tm =87°C

Tm : spécificité du produit d'amplification SYBR Green Courbe d'amplification Courbe de fusion Fluorescence Fluorescence Nombre de cycles Température °C Remarquer que les produits bleu et vert clair qui apparaissent tardivement, n'ont pas le bon Tm = amplification non spécifique Tm : spécificité du produit d'amplification Ct : quantification

Génération de la fluorescence 1- Agent se liant à l'ADN double brin ● SYBR Green I 2- Utilisation de sondes ● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman ● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) ● Molecular Beacons (balises moléculaires)

Sondes Taqman - Principe Hybridation d'une sonde spécifique Composition de la sonde ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5' Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein ● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine  pas d'émission de fluorescence Qd il est stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le ppe FRET qui dissipe l'énergie sous forme de chaleur. Comme l'activité 5'exonucléasique de la Taq est sp de l'ADN double brin, les sondes libres en solution demeurent intactes et aucune fluo n'est émise Lors de l'élongation, la Taq déplace la sonde et l'hydrolyse. Le reporter est alors libère de l'environnement suppresseur permettant ainsi l'émission de fluorescence qui augmente à chaque cycle proportionnellement aux taux d'hydrolyse de la sonde Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

Sondes Taqman - Principe Cette méthode repose sur deux principes : - la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol Reporter Quencher FP 3’ 5’ FAM, VIC TAMRA La fluorescence émise par le reporter est absorbée par le quencher 5’ 3’ RP  Spécificité des amorces pour la PCR  Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

Sondes Taqman - Principe Lumière FP R Q 3’ 5’ 5’ 3’ RP - FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

R FP Q 3’ 5’ 5’ 3’ RP - au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde  libération du reporter R Q FP 3’ 5’ 5’ 3’ RP - lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.

 La fluorescence est proportionnelle aux taux d'hydrolyse de la sonde hybridée donc à la quantité de produit d'amplification

Sondes Taqman Avantage : - Spécificité accrue Spécificité des primers pour la PCR Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan - Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents Inconvénient : - Impossibilité de réaliser des courbes de fusion

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ● Utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires d'une séquence cible - Une sonde marquée en 3' par un marqueur fluorescent, qui émet une fluorescence verte - Une sonde marquée en 5' par un fluorochrome accepteur, qui émet une fluorescence rouge ● Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible  proximité des fluorochromes Transfert d'énergie  fluorescence rouge FRET works with two differently labeled probes. The first oligonucleotide is labeled at the 3'-end (usually with fluorescein) and the second oligonucleotide is labeled at the 5'-end with a FRET acceptor (e. g. Cy5TMor TAMRA). The first oligonucleotide hybridizes to the target in such a way that its 3'-end is separated from the 5'-end of the second oligonucleotide by no more than 1 base. - When no complementary sequence is available only the fluorescence of the donor is visible. - If the target is present the labeled probes will hybridize with the target and FRET can occur. The fluorescence of the acceptor is mediated by the quencher that emits fluorescence at a longer wavelength than that of the acceptor. The fluorescence intensity is proportional to the amount of PCR product formed during the early exponential phase of PCR (threshold value). The 3'-ends of both probes have to be protected against chain elongation during PCR. En solution, bruit de fond de fluorescence verte Pendant l'hybridation, fluorescence verte

FRET Dénaturation Hybridation Elongation La sonde qui possède un fluorochrome donneur en 3' produit une fluorescence verte sous excitation En solution, les 2 sondes sont séparées. Il existe un bruit de fond de fluorescence verte émis par le fluorochrome donneur Pdt l'hybridation, les 2 sondes se fixent sur leur séquence respectives localisées à moins de 10 nt dans un arrangement "t^te à queue". Transfert d'énergie et émision fluorescente Pdt l'élongation, les 2 sondes retournent de façon indépendante en solution ce qui supprime l'émission de fluorescence rouge Le signal ne dépend que de l'hybridation (Taqman : hybridation et hydrolyse de la sonde) L'acquisition du signal est température dépendant (pdt l'hybridation). Peut être utilisé en courbe de fusion (SNP : recherche de mutations)???? Elongation  L'acquisition du signal se fait pendant l'hybridation. L'accroissement de fluorescence rouge est proportionnel à la quantité d'ADN synthétisé

Molecular beacons = sonde d'hybridation en épingle à cheveux appelée balise moléculaire - Une boucle : séquence complémentaire d'une séquence cible de l'ADN - Deux bras de séquences complémentaires - Un fluorochrome émetteur (ex : FAM, ROX, TET) - Un fluorochrome suppresseur, non fluorescent. Il dissipe l'énergie de l'émetteur en chaleur (FRET) Fluorochrome émetteur Fluorochrome suppresseur = quencher

Molecular beacons 1- Dénaturation 2- Hybridation 3- Elongation balises libres : pas de fluorescence 2- Hybridation La sonde s'hybride préférentiellement à sa séquence cible complémentaire sur la matrice Emission de fluorescence Si la séquence cible ne correspond pas parfaitement à la séquence de la balise moléculaire, aucune hybridation et donc aucune émission de fluorescence ne survient Ceci est du aux propriétés thermodynamiques de la balise moléculaire qui favorisent surtout la formation de l'épingle à cheveux sauf en cas d'hybridation parfaite des séquences 3- Elongation Libération de la balise : pas de fluorescence

Molecular beacons Avantages - Très spécifique : détections des SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Si la séquence cible ne correspond pas parfaitement à la balise moléculaire, pas d'hybridation donc pas d'émission de fluorescence (formation en épingle à cheveux thermodynamiquement plus stable) Inconvénient - Difficulté du design des sondes d'hybridation

Les appareils de PCR en temps réel

LightCycler (Roche Diagnostics) Utilisation de fins capillaires en verre permettant une optimisation des échanges thermiques Le LightCycler est un thermocycleur rapide , couplé à un microspectrofluorimètre. Il est piloté par un ordinateur qui permet l’acquisition et le suivi en temps réel des données ainsi que leur traitement. Les applications sont principalement la quantification d’ARNm, par quantification fluorimètrique avec du SYBR Green l (intercalant d’ADN double brin) ou par sondes d’hydrolyse (sondes couplées à un fluorophore).  Rotor de 32 places

GeneAmp 5700 et Prism 7000 (Applied Biosystems) ABI Prism 7000  Réactions en plaque de 96 puits

COBAS Taqman (Roche Diagnostics) (48 tests)

Icycler (BioRad)  Réactions en plaque de 96 puits

MX4000 (Stratagene) et Rotor Gene (Corbett Resesarch)

SmartCycler (Cepheid)  Tubes réactionnels conçus pour optimiser les échanges thermiques et la sensibilité optique  Chaque tube peut fonctionner avec un programme indépendant

Principaux appareils de PCR en temps réel

Avantages PCR en temps réel /PCR conventionnelle PCR temps réel Préparation de l'échantillon (lyse de l'organisme, purification des AN) Manuel Automatisé Amplification et détection Plusieurs étapes Système ouvert Intégré Simultané Système fermé Système de détection Gels Radio-isotopes Enzymes Fluorochromes Temps d'analyse 4h à 48h 20 min à 2h Taux de contamination Moyen à fort Faible Taux de quantification 2-3 log 5-6 log Reproductibilité Bonne intra-labo Mauvaise inter-labo Grande (théoriquement) Traçabilité Détection, enregistrement et analyses intégrés Coût Gel : 4-5 euros SYBR Green : 4-5 euros Sondes : 10 euros

Apport de la PCR en temps réel en Bactériologie 1- Diagnostic bactériologique PCR qualitative ou quantitative 2- Etude de la résistance aux AB 3- Typage bactérien (génotypage)

1- Diagnostic bactériologique Exemple 1: Mycoplasma pneumoniae (TP jeudi) - Bactérie responsable d'infections respiratoires chez l'enfant et l'adulte jeune Culture difficile, peu sensible, en 3 semaines Antibiotiques classiquement utilisés (β-lactamines) inactifs A Pellegrin Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic) PCR en temps réel Taqman sur ABI Prism 7700, gène de l'adhésine P1

10-3 10-1 10-2 pur Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100ème, 1/1000ème

Patient En rouge : patient positif pour M. pneumoniae

Diagnostic bactériologique Exemple 2 : Chlamydia trachomatis (TP vendredi) - Bactérie responsable d'infections génitales souvent inapparentes chez l'homme et la femme. Complications: stérilité féminine Bactérie intracellulaire  culture cellulaire difficile  A Pellegrin - Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic) - PCR en temps réel Taqman sur COBAS Taqman

Diagnostic bactériologique Exemple 3 : Neisseria meningitidis (méningocoque) - Bactérie responsable de méningites graves. Diagnostic et traitement antibiotique sont une urgence vitale. Nécessité d'une prophylaxie pour l'entourage (AB ou vaccin) la culture bactérienne nécessite 24 heures  A Pellegrin - Culture classique - PCR en temps réel SYBR Green (gène ctrA, Pr de mb externe) PCR méningo positive jusqu'à 18h après instauration d'une ABttt

Amplification du gène ctrA de N. meningitidis Témoin + patient Peut-on affirmer qu'il s'agit d'un méningo? Non : vérification de la courbe de fusion obligatoire

Témoin + patient eau

Diagnostic bactériologique à Pellegrin Germes Gènes Principaux échantillons Extraction Amplification1 Intérêt M. pneumoniae Adhésine P1 (P de mb) Respiratoires MagNA Pure TaqMan Culture difficile C. pneumoniae PMP4 Culture exceptionnelle C. psittacci IncA (P mb d'inclusion) respiratoires Taqman Culture facile mais secteur protégé P3 C. trachomatis Plasmide cryptique Génitaux Urine -COBAS Amplicor -Taqman (COBAS Taqman) Culture difficile (cellulaire) M. genitalium Adhésine MgPa SYBR Green puis Culture impossible M. tuberculosis (BK) ARNr 16S LCR, divers Kit COBAS COBAS Amplicor (PCR ELISA pt final) Culture très lente N. meningitidis ctrA (P de mb externe) LCR Manuelle2 SYBR Green Diagnostic d'urgence B. pertussis B. parapertussis IS 481 IS 1001 S.aureus (+/- mecA) Fragment sa442 mecA Souche isolée Si identification difficile PCR universelle 16S (pt fragment bactérien) Prélèvements divers Manuelle2 ou MagNAPure Contrôle d'extraction PCR universelle 16S (grand fragment) Identification bactérienne 1Amplification par PCR en temps réel sauf COBAS Amplicor 2Extraction manuelle avec un tampon de lyse (Triton, Tween, Tris-EDTA)  Ebullition 10 min  centrifugation  surnageant

2- Etude de la résistance aux antibiotiques Exemple : Etude de la résistance à la clarithromycine chez H.pylori H.pylori : bactérie responsable de l'ulcère gastro-duodénal Clarithromycine: AB utilisé en association en 1ère intention Résistance par mutation ponctuelle d'une base de l'ARNr23S, cible de cet AB (20% des souches)  A Pellegrin PCR en temps réel, FRET sur Lightcycler

 Réalisation de courbes de fusion 2- Etude de la résistance aux antibiotiques FRET: Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible  proximité des fluorochromes  Transfert d'énergie  fluorescence rouge Mutation Sonde bleue = sonde d'ancrage Sonde rouge = sonde de détection - S'il y a une mutation sur l'ADN cible, la sonde (rouge) est moins bien hybridée - Si on augmente la température, elle se détachera plus facilement  Réalisation de courbes de fusion

Fluorescence si hybridation parfaite Température basse moyenne élevée Hybridation parfaite Mismatch (mutation) Fluorescence Fluorescence si hybridation parfaite mais pas si mutation Pas de fluorescence

Mutations Sauvage ACA AAA AAG AGA  Si mutation, le Tm est plus faible  Technique réalisable directement à partir des biopsies gastriques

3- Typage bactérien - Typage bactérien : identifier les différents "types" ou les différentes souches d'une espèce bactérienne - Intérêts nombreux Ex : identifier une épidémie liée à une même souche Ex : identifier un type plus virulent, résistant aux AB , etc… Exemple : typage des souches de méningocoque à Pellegrin - Il existe plusieurs sérogroupes : A, B, C, Y, W135  Des vaccins existent contre les sérogroupes A, C, Y, W135 mais pas contre le sérogroupe B - Objectif du typage : si diagnostic de N. meningitidis, peut-on vacciner les sujets contacts? Si oui, avec quel vaccin?

Détermination du sérogroupe de N.meningitidis - Amplification du gène siaD (biosynthèse de la capsule des sérogroupe B, C, Y et W135) ou ou mynB (biosynthèse des polyosides de capsule du sérogroupe A). - Amorces spécifiques, différentes selon les sérogroupes - PCR temps réel SYBR Green sur ABI prism 7000 durée 2-3 heures

Recherche du sérogroupe B Témoin + patient

Recherche du sérogroupe C Témoin + patient

Confirmation : analyse de la courbe de fusion patient Témoin + Il s'agit d'un méningo du groupe C : chimioprophylaxie + vaccination avec un vaccin anti-C, oligosidique, conjugué à une protéine (meningitec) Autres vaccins en France Vaccin méningococcique polyosidique A+C* (non conjugué) qui protège contre les infections à méningocoques des sérogroupes A et C, il est divalent, et est immunogène à partir de l'âge de 18 mois; Menomune*, vaccin polyosidique (non conjugué) qui protège contre les infections à méningocoques des sérogroupes A, C, W-135 et Y, il est quadrivalent, et est immunogène à partir de l'age de 18 mois;

Recherche du sérogroupe W135 Témoin + patient

Conclusion Avantages de la PCR en temps réel ● Automatisation ● Rapidité ● Spécificité ● Sensibilité ● Faible risque de contamination Place dans un laboratoire de Bactériologie ● Diagnostic de bactéries non ou difficilement cultivable ● Diagnostic d'urgence ● Etude de la résistance aux AB de bactéries difficilement cultivables ● Typage moléculaire

fluorescence nbre de cycles

TaqMan® MGB probes NFQ non fluorescent quencher Nouvelle innovation MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)