La Mucoviscidose et le gène cftr Philippe ROUSSEAU Maître de conférence LMGM, IBCG Tel: 05 61 33 59 16 Mail: philippe.rousseau@ibcg.biotoul.fr http//www.iefg.biotoul.fr La Mucoviscidose et le gène cftr 1) Première Partie: - Analyse de l’hérédité de la maladie - Fonction du gène cftr 2) Deuxième Partie: - Conséquences fonctionnelles des 6 classes de mutations

La Mucoviscidose et le gène cftr 1) Première Partie: - Analyse de l’hérédité de la maladie - Fonction du gène cftr 2) Deuxième Partie: - Conséquences fonctionnelles des 6 classes de mutations

Les conséquences de la mucoviscidose Accumulation de mucus perturbant le fonctionnement de certains canaux. Voies aériennes Atteintes hépatiques 5% Pancréas 85% Intestin grêle 10% Peau : glandes sudoripares sueur salée Appareil reproducteur 95% des hommes stériles

Généalogie d’une famille atteinte par la mucoviscidose, 1 II III IV L’arbre généalogique révèle le caractère récessif de la maladie La maladie apparaît dans la descendance de deux individus non malades

Généalogie d’une famille atteinte par la mucoviscidose, 2 II mariage consanguain III IV Dans cette famille, les enfants atteints sont issus d’un mariage entre cousins germains. Chacun des cousins est porteur.

Généalogie d’une famille atteinte par la mucoviscidose, 3 II mariage consanguain III IV Dans cette famille, un des parents I au moins était porteur de la maladie.

La mucoviscidose est lié à la mutation du gène cftr digestion tryspsine + coloration Giemsa p, bras court Bandes sombres : appelées G Bandes claires: appelées G négatif centromère q, bras long Le gène cftr localisé en 1985 sur le bras long du chromosome 7 en position 7q31 analyse de la liaison avec des marqueurs moléculaires Chromosome 7

Hérédité monogénique de la mucoviscidose, 1 mariage consanguain cftr+ Gamètes cftr+ cftr- cftr- ½ ½ Un hétérozygote produit: - 50 % de gamètes normaux - 50 % de gamètes porteur de la mutation (1ére loi de Mendel)

La mucoviscidose est une maladie monogénique, 2 cftr+ cftr- mariage consanguain cftr+ cftr- ½ cftr+ , ½ cftr- ½ cftr+ , ½ cftr- ½ cftr+ ½ cftr- ½ cftr+ ½ cftr- sain Porteur malade 25 % de chance d’avoir un enfant malade. Pour les petits effectifs, la variabilité autour de ces valeurs est grande

La mucoviscidose est une maladie monogénique, 3 cftr+ cftr- I cftr+ cftr- cftr+ cftr- II Générations II et III: - une chance sur deux d’être porteur. - aucune chance d’être malade. cftr+ cftr- III cftr+ cftr- Générations VI: - une chance sur deux d’être porteur. une chance sur quatre d’être malade. IV cftr- cftr-

La mucoviscidose: épidémiologie C’est la plus fréquente des maladies autosomiques récessives graves dans les populations d’origine européenne. Soit q, la fréquence de l’allèle cftr - dans la population. Soit p, la fréquence de l’allèle cftr + dans la population. Les 1/2500 nouveau-nés touchés par la maladie correspondent à q2 : probabilité de rencontre de deux allèles cftr-, soit q= 1/50. cftr+ ; p = (1-q) cftr- ; q = 1/50 cftr+ ; P = (1-q) Sain = (1-q)2 Porteur = pq cftr- ; q = 1/50 Porteur = pq malade = q2 = 0,9604 = 0,0196 = 0,0196 = 0,0004 On peut évaluer à 2pq la fréquence de porteurs hétérozygotes à environ 1/25 (ou 4%) de la population.

La mucoviscidose: le gène cftr Biologistes Moléculaires et biochimistes ont collaboré pour isoler le gène cftr et étudier la protéine CFTR. Le gène de 230 Kilobases, transcrit en un ARN messager de 6,5Kb, contient 27 exons. La protéine CFTR est composée de 1480 acides aminés et de 5 domaines. Elle constitue un canal chlore.

La protéine CFTR: 1480 aa, 5 domaines, canal chlore,régulée par l’ATP fonction de cftr Cl- N ATP ATP Chromosome 7 Cftr+ C Cl- Cftr+ La protéine CFTR: 1480 aa, 5 domaines, canal chlore,régulée par l’ATP 5’ 3’ TM1 NBF R TM2 NBF Le gène cftr : 230 Kb; ARNm 6,5 Kb; 27 exons.

La Mucoviscidose et le gène cftr 1) Première Partie: - Hérédité de la maladie - Fonction du gène cftr 2) Deuxième Partie: - Conséquences fonctionnelles des 6 classes de mutations

Les mutations de cftr Il existe 6 classes de mutations qui touchent le gène cftr. - classe I(A et B): protéine CFTR non exprimée - classe II: protéine CFTR mal synthétisée - classe III: la fonction de la protéine CFTR est mal régulée - classe IV: la conduction ionique par CFTR est altérée - classes V et VI: moins de protéine CFTR produite

Classe I-A de mutant de cftr : pas de protéine exprimée Chromosome 7 Classe I-A : Mutations qui affectent la production de la protéine: CFTR n’est pas produite. A cause d’une mutations non sens cftr- cftr- 5’ 3’ UGG UGA Trp Stop

Classe I-B de mutant de cftr : pas de protéine exprimée Mutations qui affectent la production de la protéine: CFTR n’est pas produite. A cause d’une mutation de décalage de phase. Addition ou délétion d’une paire d’une base. La protéine produite sera tronquée. Chromosome 7 cftr- cftr- 5’ 3’ 5’ GAT CGG GGG GAT AGG GAT3’ 5’ GAT CGG GGG GGA TAG GGA T 3’ Asp Ala Gly Asp Glu Asp Asp Ala Gly Gly stop

Classe II de mutant de cftr : protéine mal synthétisée La protéine n’a pas sa fonction car elle n’est pas correctementsynthétisée. Exemple: un mauvais ciblage de la protéine vers la membrane plasmique pour le mutant DF508. N C Chromosome 7 cftr- cftr- 5’ 3’ ATC ATC TTT GGT ATC ATT GGT DF508: La délétion du triplet CTT dans l’éxon 10 donne une protéine plus courte d’un acide aminé: une phénylalanine.

Classe III de mutant de cftr : la protéine est mal régulée mutation des sites de fixation de l’ATP. Pas de signal d’ouverture. exemple : la mutation faux sens G551D la glycine en position 551 est remplacée par l’acide aspartique. ATP ATP Chromosome 7 C cftr- Cl- cftr- 5’ 3’ GGU GAU Gly Asp

Classe IV de mutant de cftr : la conduction ionique est altérée mutations altérant la conduction et la sélectivité ionique. ce sont des mutations des régions transmembranaires. Chromosome 7 cftr- ATP ATP cftr- C Cl- ou autres Exemple : mutations faux sens dans TM1 et TM2 R117H (Arginine en histidine) R334WArginine en tryptophane Le flux de Cl- est diminué la sélectivité est modifiée. 5’ 3’

Classe V de mutant de cftr : moins de protéine produite Diminution du nombre de canaux chlore par défaut de synthèse des protéines CFTR. Défaut d’épissage altérant la stabilité de l’ARN messager CFTR. Chromosome 7 cftr- ATP ATP cftr- C Cl- Exemple: défaut d’épissage entre l’intron 8 et l’exon 9, l’ARN messager est instable. 5’ 3’

Classe VI de mutant de cftr : moins de protéine produite Mutations affectant la stabilité de la protéine. Chromosome 7 cftr- ATP ATP C cftr- Cl- Exemple : Délétion de la partie C-terminale de la protéine qui devient instable 5’ 3’

Les six classes de mutations de cftr classe IV: la conduction ionique est altérée classes V et VI: moins de protéine produite Cl- Cl- ou autres classe III: la fonction de la protéine CFTR est mal régulée Cl- Cl- Cl- ou autre classe I: protéine CFTR non exprimée classe II: protéine CFTR mal synthétisée Chrs. 7 gène cftr cftr- 5’ 3’ cftr- TM1 NBF R TM2 NBF

Répartition des mutations de cftr dans la population, 1 900 mutations différentes ont été décrites. La mucoviscidose est une maladie multiallélique. 67% des mutations sont la délétion DF508 - 45% faux sens - 18% non sens - 23% insertions et délétions - 14% sont des mutations d’épissage La maladie est récessive : le phénotype de la mucoviscidose s’exprime quand les deux allèles cftr portent des mutations qui entraînent une perte de fonction de la protéine CFTR. Tous les malades de mucoviscidose sont donc homozygotes. La perte de fonction de la protéine CFTR sera plus ou moins grave, selon la mutation, allant de l’absence complète des canaux, à une moindre sélectivité ionique ou à une diminution du nombre de canaux.

Répartition des mutations de cftr dans la population, 1 La mucoviscidose est une maladie multiallélique comportant 900 mutations différentes avec des disparités régionales et ethniques. Exemple :En Europe, la délétion DF 508 représente 88% au Danemark, 81% en Bretagne et 50% en Italie. La mutation G551D semble spécifique des populations d’origine celte 5 à 20% (Royaume uni, Bretagne)

Répartition des mutations de cftr dans la population, 2 Toutes les combinaisons entre ces allèles mutants seront possibles DF508 DF508 Faux sens,1 DF508 Autre mutation Faux sens,2 40% « hétérozygote » composite DF508 50% homozygotes 10% « hétérozygote » composite Autres mutations

Pour les mariages consanguins, les malades sont des homozygotes « vrai » pour la mutation. DF508 cftr+ I II DF508 cftr+ DF508 cftr+ III DF508 cftr+ DF508 cftr+ IV DF508 DF508

Espoirs thérapeutiques Thérapie génique Elle consiste à apporter le gène fonctionnel aux cellules et permettre la synthèse d’une protéine CFTR. Le gène est introduit dans les cellules grâce à des vecteurs d’origine virale (adénovirus) ou synthétique (liposomes). 26 essais ont été réalisés en Europe et aux Etats-Unis : les résultats sont encourageants mais modestes. Le gène est transféré, bien toléré, mais de manière transitoire. Obstacles à surmonter : Trouver un vecteur capable d’infecter les cellules mais non détruit par le système immunitaire, et capable de transférer le gène de manière durable. Cibler les cellules que le vecteur doit atteindre. Vérifier que la technique est sans danger pour les patients et son environnement.