LES CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES HUMAINES NORMALES : RÉGULATION ET MÉTHODES D’EXPLORATION S. Fichelson, 17 Juin 2004 – 5èmes journées du GFM - Rouen

SOMMAIRE Transdifférenciation : polémiques Ontogénèse Définition des cellules souches Transdifférenciation : polémiques Ontogénèse Méthodes d’exploration Régulation Expansion

Les Cellules Souches ¢ MATURES TOTIPOTENTES PLURIPOTENTES Endoderme Mésoderme Ectoderme Tous les organismes multicellulaires sont issus de cellules souches embryonnaires dite totipotentes puisqu’elles seront capables de générer tous les tissus de cet organisme. Ces cellules souches embryonnaires, tout au long du développement vont progressivement acquérir des spécificités tissulaires et restreindre leur potentiel de prolifération et de différenciation, d’abord très tôt, dans la formation des 3 feuillets embryonnaires puis, au sein des 3 feuillets, dans la mise en place des différents organes au sein desquels persisteront à l’âge adulte, des cellules souches adultes pluripotentes qui seront capables d’assurer le renouvellement de la diversité cellulaire d’un organe ou d’un système. Quoi qu’il en soit, les cellules souches, par définition, sont des cellules indifférenciées capables d’assurer leur propre renouvellement tout en produisant des cellules filles destinées à se différencier, générant ainsi l’ensemble des lignées cellulaires d’un tissu donné. A terme, on aboutit, pour chaque tissu spécialisé, à un système cellulaire pyramidal et hiérarchisé, notamment bien décrit pour le système hématopoïétique, et qui commence à être bien documenté pour de nombreux autres tissus. MULTIPOTENTES PROGÉNITEURS ¢ MATURES Tissu Hématopoïétique Foie Intestin Muscle Peau Cerveau

« TRANSDIFFÉRENCIATION » DES CELLULES SOUCHES Nombreuses études in vivo et in vitro chez la souris Mise en évidence du phénomène de transdifférenciation (1999-2003): Transdifférenciation = phénomène rare + contexte de régénération post-lésionnelle

le concept de transdifférenciation Controverses sur le concept de transdifférenciation Reprogrammation ? Fusion cellulaire ? Homing ectopique? Populations hétérogènes de ¢ souches ?

Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates FD Camargo, R Green, Y Capetenaki, KA Jackson & MA Goodel. Nat Med Dec 2003, 9: 1520-27

Ontogénèse de l’hématopoïèse chez l’homme Semaines de gestation Début de la circulation sanguine Colonisation du Foie par les précurseurs CD34+ 3 5 11 7 9 Sac Vitellin Hématopoïèse Intravasculaire (aorte, artère vitelline) Foie Thymus Moelle Osseuse

Matrice Extra-Cellulaire (Fibronectines, laminines, La « niche » hématopoïétique Matrice Extra-Cellulaire (Fibronectines, laminines, collagènes, TSP) Chimiokines Cytokines Protéoglycannes CSH Endothélium Macrophages Adipocytes Fibroblastes Myofibroblastes

Représentation schématique des différents compartiments du système hématopoïétique Moelle osseuse Thymus Tissu périphérique Cellules souches Progéniteur Myélo-érythroïde CFU-GEMM lymphoïde Pro-B Pro-NK Pro-T Pré-B Lymphocyte B Plasmocyte NK Cellule dendritique Pré-T T auxiliaire T cytotoxique Compartiment des cellules souches Compartiment des progéniteurs Compartiment de maturation Précurseurs et cellules matures sang Cellules dendritiques CFU-GM CFU-M Pro-Monocyte Monocyte Macrophage CFU-G neutrophile éosinophile CFU-Eo basophile CFU-Baso Mastocyte BFU-MK BFU-E Mégacaryocyte Plaquettes Érythroblaste Érythrocyte Myélocytes Granulocytes Lympho-myéloïde

MÉTHODES D’EXPLORATION DES CSH Caractéristiques phénotypiques  Caractéristiques fonctionnelles

I- Caractéristiques phénotypiques des cellules hématopoïétiques humaines Progéniteur Immature Progéniteur Mature Précurseur Différencié CSH Différenciation Différenciation Maturation MARQUEURS IMMUNULOGIQUES CD34+ ou - CD38- Lin- Thy-1- CD34+ CD38- Lin- Thy-1+ CD34+ CD38+ Lin± Thy-1± CD34- CD38+ Lin+ Thy-1- MARQUEURS FONCTIONNELS Quiescente Résistante au 5-FU Rhod 123 faible Quiescente Résistante au 5-FU Rhod 123 faible En cycle Sensible au 5-FU Rhod 123 fort En cycle Sensible au 5-FU Rhod 123 fort

Séquence d’expression des marqueurs Cellules souches Progéniteurs Précurseurs Cellules Matures Granulocyte Lignée Myéloïde Monocyte Erythrocyte Megacaryocyte/Plaquettes Lignée Lymphoïde Eosinophile Ag lin (CD13, CD41, GpA, CD71, CD61…) CD34 HLA-DR, CD38…

II - Tests fonctionnels pour l’étude de l’hématopoïèse CSH humaines ? CSH SRC Cultures à long terme Progéniteurs LTC-ICMy, Ly Tests clonogéniques CFC Cellules en cours de maturation Caractéristiques phénotypiques Si on représente le système hématopoïétique par un système pyramidal hiérarchisé, on définit des tests fonctionnels spécifiques, à différents niveaux de cette hiérarchie, basés sur l’étude rétrospective de la descendance des cellules à tester, après prolifération et différenciation cellulaire dans une condition donnée. Schématiquement, le compartiment le plus haut situé des CSH est abordé par des tests in vivo de greffe xénogénique dans des souris immunodéficientes de type NOD-SCID. Les cellules humaines mises ainsi en évidence sont appelées SRC pour SCID repopulating Cells. Dans le compartiments des progéniteurs, des cultures liquide à long terme dites LTC, en condition myéloïde ou lympho-myéloïdes, vont nous permettre de révéler la présence de cellules dites LTC-IC capables de générer, au terme de 5 à 8 semaines, des cellules plus matures clonogéniques. Les cellules clonogéniques, dites CFC, de type CFU-GEMM, CFU-GM, BFU-E… vont elles être capables en 15 jours, de former, en milieu semi-solide, des colonies morphologiquement identifiables. On peut aussi générer dans certaines conditions de culture, des cellules qui seront sont phénotypiquement identifiables, soit directement morphologiquement identifiables. Chacun de ces tests peut être réalisé de manière quantitative.

En pratique : identification des cellules souches humaines 1- Tests in vivo de transplantation xénogénique Irradiation sub-létale (+ anti-CD122) SCID-RC (SRC) 3 - 4 mois NOD-SCID 2- Tests in vitro de culture Milieu + sérum + stroma 5 - 12 sem LTC-IC 2 sem Milieu semi-solide + cytokines CFC

Fréquence des progéniteurs hématopoïétiques humains dans le sang de cordon ombilical Progéniteurs présents au sein des ¢ mononucléées ¢ CD34+CD38- SRC 1 / 5x105 1 / 600 LTC-IC 1 / 2x104 1 / 20 CFC 1 / 250 1 / 3 7

REGULATION DES CSH Détermination Facteurs extrinsèques Facteurs intrinsèques et / ou Auto-renouvellement Différenciation

Représentation schématique du rôle des facteurs de transcription hématopoïétiques aux différents stades de la différenciation HoxB4 Bmi1 C/EBP

Représentation schématique des principales étapes cibles des facteurs extrinsèques Wnt Shh Jagged/Delta

Comment expandre les CSH ? Mise en cycle Stimulation Quiescence Délai Auto-renouvellement Inhibition X Apoptose Différenciation X Compte tenu de la biologie des cellules souches, il va falloir jouer sur plusieurs paramètres afin de découpler les processus de différenciation et de prolifération qui, lorsqu’ils sont couplés, entraînnent une perte du potentiel des CSH .

Approches expérimentales pour l’expansion des CSH humaines - CYTOKINES : FLT3-L + TPO + SCF (Kobari et al; Piacibello et al) ± IL-6 + sIL-6R (Ueda et al) - AUTRES FACTEURS SOLUBLES: Shh (via BMP4) (Bhardwaj et al) FGF-1 (de Haan et al) Wnt-5A (Murdoch et al); Wnt-3A (Willert et al) CELLULES FEEDER (co-cultures + cellules stromales) : (Connealy et al; Miller & Eaves; .... Dexter) FACTEURS DE TRANSCRIPTION : Homéoprotéines : HOXB4 (HOXC4, B3, A9, A10, ...), bHLH : Tal-1/SCL, polycomb : Bmi-1, ...

Voie Wnt/bCatenine/GSK3 dans les cellules souches 6-bromoindirubin-3’-oxime (BIO) X (Dishevelled) (Glycogen synthase kinase-3)  Différenciation  Auto-renouvellement

Effets de sa surexpression sur l’hématopoïèse murine HOXB4 : HOXB4 Contrôle Progéniteurs clonogéniques d 12 CFU-S Cellules matures CRU Sauvageau et al., 1995

Les homéoprotéines agissent sous forme de complexes transcriptionnels 13 10 9 8 1 2 MEIS1 PBX1 Coopération Paralogues Hox HOX PBX1 TGAT NNAT Fixation à l'ADN (Chang et al 1996; Shen et al 1997) HoxB4 + Knock-down de PBX1  CSH « ultra-compétitives » (x 20 par rapport aux cellules surexprimant HoxB4 seul) (J. Krosl et al, 2003)

Effets de HoxB4 dans les CSH humaines. (Buske et al Effets de HoxB4 dans les CSH humaines (Buske et al. Blood, août 2002; Schiedlmeier et al. Blood, mars 2003) Expression ectopique par transduction rétrovirale (= expression constitutive du transgène) Augmentation du nombre des cellules greffant dans les souris NOD-SCID (SRC) et des CRU (x 3-4)

Comment expandre les CSH humaines Sans utiliser de cytokines exogènes * perte de potentiel (?)  Sans transfert de gènes * mutagenèse insertionnelle * leucémogénène à long terme ? * dérégulation de l’hématopoïèse terminale ?  Transduction de la protéine HOXB4

Propriété des homéodomaines Transport intercellulaire atypique :  sécrétion spontanée et internalisation indépendante de récepteur (formation de micelles inverses) La 3ème hélice de l’homéodomaine : - permet la liaison à l’ADN - nécessaire et suffisante pour l’internalisation de la protéine

Résumé de notre travail Amsellem et al, Nat Med, nov 2003 Dans un système de co-culture de CSH humaines avec des cellules stromales sécrétant HOXB4 La PROTEINE HOXB4 est capable de pénétrer passivement dans des cellules hématopoïétiques Ce système permet une expansion des cellules hématopoïétiques humaines primitives, sans manipulation de leur génome, par passage passif (et réversible) de la protéine  Nouvelle approche pour des protocoles d’expansion ex vivo des CSH humaines