Les virus comme vecteurs thérapeutiques Par Patrick Salmon chercheur au Département de Microbiologie et Médecine Moléculaire de l’Université de Genève

Hypercholestérolémie Thérapie génique: quelques applications Parkinson, Huntington Mucoviscidose Hypercholestérolémie Hémophilie Immunodéficiences Anémies Dystrophies

Questions à se poser lorsqu’on envisage une thérapie génique Ou… WWW.genetherapy.com

WWW.genetherapy.com What? Where? When?

WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer? Quelle est la taille de sa séquence codante? WHERE? Quelles sont les cellules à cibler? WHEN? Combien de temps le transgène doit-il être exprimé? Son expression doit-elle être régulée?

Maladies candidates pour la thérapie génique MALADIE HEREDITAIRES Pathologie Défaut génétique Prévalence Cible thérapeutique Immunodéficience ADA, X-SCID rare CSH ou lympho T Hémophilie A facteur VIII 1: 10.000 mâles foie, muscle Hémophilie B facteur IX 1: 30.000 mâles CSH, fibroblaste Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1:1.000.000 foie familiale Mucoviscidose CFTR (transporteur 1:3.000 cauc. poumon des ions chlores) Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSH anémie falciforme, thalassémie Maladie de Gaucher glucocérébrosidase 1:450 (éthnie!) CSH Emphysème héréditaire a-1 antitrypsine 1:3.500 foie et poumon

Maladies candidates pour la thérapie génique MALADIE ACQUISES Pathologie Prévalence Cible thérapeutique Cancer 1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes maladies dégénératives: Parkinson 1 million aux USA Alzheimer 4 millions aux USA neurones, cellules gliales désordres « immunologiques »: diabète de type I dizaines de millions cellules b du pancréas, autres… Cardiovasculaire: resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires maladies infectieuses: SIDA, hépatite B ou C centaines de millions CSH, hépatocytes

MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent adéquat... Le vecteur idéal Est défini par les exigences thérapeutiques (expression stable ou transitoire). Peut atteindre de hautes concentrations permettant l’infection de nombreuses cellules. Est aisément produit par des techniques reproductibles. Pour l'expression à long terme, est intégré dans un site spécifique du chromosome, ou persiste en épisome stable. Possède une unité transcriptionelle contrôlable. Cible certaines cellules spécifiquement. Est dénué de composants induisant une réponse immunitaire. MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent adéquat...

Génétiquement Modifiées Thérapie génique: in ou ex? Isolation Vecteur Cellules Injection Vecteur Transplantation In vivo Ex vivo Cellules Génétiquement Modifiées

Vecteurs pour la thérapie génique Viraux adénovirus virus adéno-associé (AAV) rétrovirus: oncorétrovirus lentivirus virus herpes virus à ARN (polio, sendaï, etc…) Non viraux ADN nu liposomes

Vecteurs viraux

Vecteurs viraux

Trois familles de virus utilisés pour le développement de vecteurs AAV Adénovirus Rétrovirus

Adénovirus AAAH! Grande capacité (30-40 kb) Facile à produire à hauts titres Infecte les cellules non-mitotiques Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 70-90 nm OOOOH… Ne s’intègre pas Immunogénique (moins si « éviscéré ») Peut induire une « acute phase response »

AAV AAAH! Infecte les cellules non-mitotiques LE VIRUS s’intègre à un site spécifique Non-enveloppé Génome: ADN Taille: 20-30 nm OOOOH… Faible capacité (4 kb) Difficulté de production (« dependovirus! ») LE VECTEUR s’intègre au hasard Immunogénicité conditionnée par la contamination par le virus helper

Retrovirus AAAH! Capacité raisonnable (10 kb) Facilité de production adéquate Infecte les cellules non-mitotiques (LENTIVIRUS) S’intègre Pas de transfert de séquences codantes virales Enveloppé Génome: ARN-ADN Taille: 90-120 nm OOOOH… S’intègre au hasard N’infecte pas les cellules non-mitotiques (ONCORETROVIRUS)

Post-traductionnelles Cycle de réplication du HIV Fusion Modifications Post-traductionnelles Synthèse Proteines decapsidation Attachement Maturation Export Nucléaire Retro- Transcription Assemblage bourgeonnement Transcription Import Nucléaire Intégration CD4 CCR5 CXCR4

Transduction par vecteur lentiviral Fusion / Décapsidation Rétro-Transcription Import Nucléaire Attachement Intégration Expression Endocytose

Quelques dates marquantes… 1996: Un vecteur lentiviral peut effectuer le transfert, l’intégration et l’expression à long terme un gène dans les neurones in vivo. 1998: Transduction stable de CSH humaines capables de reconstituer des souris NOD/SCID. 2000: Traitement de la mucopolysacharidose, du Parkinson et de la thalassemie dans des rongeurs. 2002: transgenèse avec vecteur lentiviral. 2003: Premier essai clinique avec un vecteur lentiviral.

Plasmides d’empaquetage lentivecteurs: VPR VPU NEF GAG VIF POL Génome HIV-1 LTR LTR T A T R E V Plasmides d’empaquetage lentivecteurs: VPR VPU NEF GAG VIF 1e génération CMV POL polyA T A T R E V GAG CMV POL polyA 2e génération T A T R E V GAG CMV POL polyA 3e génération RSV polyA REV 30

Vecteur de transfert vpu nef gag vif env vpr tat rev pol Y rev RRE env vpr tat rev pol cPPT LTR Y dPPT LTR rev éléments actifs en cis LTR Y RRE dPPT LTR cPPT SD SA Capacité: 10 kb 29

Prototypes de lentivecteurs RRE cPPT Ubiquiste Y EF1-a SIN Gene X WPRE SIN RRE Spécifique cPPT Y gp91phox SIN Gene X WPRE SIN RRE Inductible cPPT Y Tet-O SIN Gene X WPRE SIN RRE cPPT Bicistronique Y SIN Gene X Gene Y WPRE SIN RRE cPPT Inhibiteur Y SIN Gene X SIN U6 sihRNA U6 sihRNA

Production de lentivecteurs WPRE Gene X LTR Y cPPT RRE GAG CMV POL An REV RSV An 293T VSV G CMV An 50 TU/cellule x jour

Lignée stable productrice de lentivecteurs WPRE Gene X LTR Y cPPT RRE GAG CMV POL An REV Tet An VSV G Tet An Dox 30 TU/cellule x jour

Titration d’un vecteur lentiviral Décompte des particules: p24-CA Décompte des génomes: real-time QPCR Titration provirale: real time QPCR 2. Expression du trangène: FACS, etc…

Applications

Hepatocytes comme cibles de thérapie génique Pour le traitement de maladies hépatiques Crigler-Najjar type I (Bilirubine UDP-Glucuronosyl transferase) Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl acetoacetate hydrolase) Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase) Maladie de Wilson (ATP 7B) Hépatite viral B ou C (Immunisation intracellulaire) Comme site de production de protéines systémiques Maladies génétiques hépatiques Emphysème (alpha-1 Antitrypsine) Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX) Trouble du métabolisme lipidique (Apolipoprotéines) Maladies génétiques non-hépatiques Diabète type I (Insulin, PDX-I) Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase) Thalassémie (Erythropoiétine)

Hypercholestérolémie homozygote familiale (récepteur low-density lipoproteins -LDL-) Réimplantation Récolte Transfert de gène Culture Purification des hépatocytes Lobectomie 20%

70% hepatectomy 2x107 hep. Gfp-LV, moi 10, with vit E 5 wks 1% FL2 0.02% 31% GFP

(transdifferenciation?) Précurseur myeloide Migration (transdifferenciation?) Neutrophiles, monocytes CSH Précurseur Lymphoide Lymphocytes Précurseur érythroide Erythrocytes

CSH IL-7 IL-15 IL-7 IL-15 IL-7 Précurseur myéloide Neutrophiles, monocytes IL-7 IL-15 IL-7 IL-15 IL-7 CSH Précurseur lymphoide Lymphocytes T Précurseur érythroide Erythrocytes

Il-7 et homéostase des lymphocytes T IL-7Ra gc JAK3 JAK1 Y P PI3-K STAT5a Bad P-Bad STAT3 STAT5b Bcl-2 Bcl-X Cyt C Anti-apoptose Pro-differenciation

X-SCID CSH IL-7 IL-7 IL-15 IL-15 IL-7 Lymphocytes T Précurseur lymphoide

Génétiquement Modifiées Thérapie génique des « enfants bulles » Isolation des CSH Chaîne g ILR LTR Transduction Transplantation CSH Génétiquement Modifiées

Thérapie génique X-SCID Vecteur: MLV (oncorétrovirus) Cibles: ~ 2x108 cellules CD34+ activées Efficacité de transduction: ~ 30% Fraction de cellules sanguines positives pour le transgène: - lymphocytes T: ~ 100% - neutrophiles: ~ 0.1% Chaîne g ILR LTR

Oncogenèse par intégration Oncogène Effet “enhancer” Effet promoteur Transgène LTR Promoteur Oncogène

Leucémie post-thérapie génique X-SCID Exon 5 Exon 4 Promoteur LMO2 Exon 1 Exon 3 Chaîne g ILR LTR Exon 2

IL-15 IL-7 IL-7 IL-7 IL-15 IL-7 IL-7 IL-15

Thérapie génique X-SCID 11 enfants traités 1 sans réponse 2 leucémies (1 rémission, 1 rechute) 8 à la maison avec une vie normale

Thérapie génique SCID-ADA 4 enfants traités 4 enfants guéris

Conclusion: les vecteurs viraux peuvent être thérapeutiques, MAIS…

Quelques axes de recherche en thérapie génique vectorologie (ex: ciblage) toxicologie (ex: oncogenèse) immunologie (ex: tolérization) développement de modèles

Intégration des vecteurs rétroviraux HIV Promoteur Exon 1 Exon 3 Exon 2 Exon 4 MLV

Intégration ciblée Promoteur Exon 1 Exon 3 Exon 2 Exon 4