Présenté par: - Nathalie ROUSSEAU -Sarah MERAD -Adiza SEYDOU Master MICROBIOLOGIE, ECOLOGIE Parcours Recherche « Ecologie Microbienne » Université Claude Bernard Lyon 1 Secrétariat : Batiment G.Mendel- 4éme étage 43 boulevard du 11 novembre 1918 69 622 VILLEURBANNE CEDEX Tél : 04 78 77 86 57 - Fax : 04 78 77 86 58 Courriel : master2. ecomi@univ-lyon1.fr Identification des déterminants de virulence de Haemophilus ducreyi responsable d’ulcére par la technique STM -Signature-Tagged Mutagenesis - Présenté par: - Nathalie ROUSSEAU -Sarah MERAD -Adiza SEYDOU

facteur favorisant la pénétration et transmission de VIH Introduction Haemophilus ducreyi (bacille de Ducrey) coccobacille, Gram – sexuellement transmissible chancre mou facteur favorisant la pénétration et transmission de VIH Ulcérations génitales Prostituées Hommes++++ Femmes ++

Introduction Objectif Identifier in-vivo les facteurs de virulence responsables de la formation d'ulcères exprimés dans le génome d’H. ducreyi par technique STM.

Matériels et méthodes Souches utilisées: Haemophilus ducreyi sauvage 35000HP H. ducreyi transformée électroporation E-coli TOP10: cellule hôte clonage Modèle animal: TDRM Temperature-dependent rabbit model

Matériels et méthodes Signature-Tagged Mutagenesis -STM- méthode de sélection négative But : détecter les gènes de virulence (ou gènes indispensables à l’infection) dans le génome bactérien Technique : Inactivation aléatoire de gènes grâce à des transposons Comparaison in vitro/in vivo des souches sauvages et mutantes

Matériels et méthodes Principe général

Matériels et méthodes Construction des STM Construction du STM contrôle positif Obtention des souches mutantes d’ H. ducreyi (pool de mutants) Inoculation à l’animal Comparaison « input » - « output » : PCR

Clonage dans E.coli TOP 10

 « Bibliothèques » de mutants : # 500 mutants Matériels et méthodes Obtention des souches mutantes d’ H. ducreyi Incorporation des plasmides construits dans H. ducreyi par électroporation Insertion unique et aléatoire des transposons + tag dans génome bactérien  « Bibliothèques » de mutants : # 500 mutants Mise en culture Sélection des souches mutantes de croissance rapide (essais de compétition) : pool « input » = pool in vitro Inoculation à l’animal  pool « output » = pool in vivo

Inoculation à l’animal et comparaison des pool input et ouput

Résultats et discussion Gènes virulents : hgbA (contrôle positif) hicB Gènes associés à une faible virulence : dnaK tdhA

Conclusion Les gènes responsables de la pathogenèse d’H. ducreyi peuvent servir de cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du chancre mou.

Merci pour votre attention