Sensitive and specific detection of almond (Prunus dulcis) in commercial food products by real-time PCR ADLI Mahdi GARDETTE Marion MERCIER Fanny

Introduction Matériels et méthodeRésultats Amande Effet nutritif positif : - baisse taux cholestérol - protection contre diabète Utilisation dans de nb produit Entre 1997 et 2007: Production x 2 = million tonnes A dose minimale : Réponse immunologique anormale  Choc anaphylactique Souvent ingestion accidentelle Sur 11 ans : augmentation allergie de 1,3% chez adulte 2,1% chez l’enfant

 Lignes directives 1169/2011/EC : obligation de mentionner si présence d’amandes et autres composants allergiques  Développement d’une méthode de détection de présence d’amandes dans les aliments par PCR- RT en recherchant le gène ITS1 Introduction Matériels et méthodeRésultats

Sélection des échantillons 35 cultivars d'amandier différents (feuilles et noyaux simples) 4 variétés commerciales ( noyaux simple ) Introduction Matériels et méthodeRésultats Extraction d’ADN kit de système de nettoyage d'ADN Wizard (Promega) : extractions rapides à l'aide de réactifs prêts à l'emploi électrophorèse sur gel d’agarose

Amorces oligonucléotidiques et sondes  Séquençage de la gène de séquence ITS pour l’allergène cible Introduction Matériels et méthodeRésultats

Hybridation 60 °C Elongation 40 °C Dénaturation 95 °C Introduction Matériels et méthodeRésultats

PCR en temps réel basée sur la région ITS 1 Intérêts :  Amplification à partir de faibles quantité d’ADN  Augmentation sensibilité de la PCR  Grande variation de séquences  Différentiation d’espèces très proches Introduction Matériels et méthodeRésultats

de la PCR Réactions croisées possibles avec Prunus  35 espèces testées : pas d’amplification du système RT-PCR ITS 1  48 espèces de plantes et 4 animales : Amplification fragment de 76 pb pour l’amande seulement  35 variétés d’amandes cultivées et 4 sauvages : Amplification pour toutes les variétés Introduction Matériels et méthodeRésultats Vérification de la spécificité

Courbe de calibration Amandes brutes ou traitées thermiquement Mélange avec de la farine de blé Teneurs croissantes en amande Introduction Matériels et méthodeRésultats  Bonne sensibilité  Amplification fragments courts

Analyse des produits alimentaires 214 produits analysés :  28 contenant de l’amande dans les ingrédients  63 pouvant contenir des traces de noix  123 ne déclarant pas la présence de d’amandes  Résultats non concordants pour 50 produits n’indiquant pas la présence d’amandes Introduction Matériels et méthodeRésultats

Introduction Matériels et méthodeRésultats Quantification : Produits déclarant présence d’amandes : Facteurs affectant le rendement d’ADN : Dégradation ADN due au processus de fabrication Présence d’autres matrices alimentaires  ADN pouvant interférer avec la réaction de PCR Analyse des produits alimentaires  Quantité détectée inférieure à celle déclarée

Introduction Matériels et méthodeRésultats Quantification : Produits ne déclarant pas présence d’amandes : Quantification non fiable : indicateur de la présence d’allergènes dans le produit  Contamination au cours de la production  Problème de santé pour les individus sensibles Analyse des produits alimentaires Nombre d’échantillonsQuantité détectés (mg/kg) 40 < >50

Conclusion Etiquetage pas toujours fiable  Danger potentiel PCR en temps réel sur ITS 1 : Bonne méthode :  Sensibilité élevée : détection jusqu’à 1 mg/kg  Applicable en routine pour contrôle qualité