22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy ANALYSE DE L’EXPRESSION DE PROTEINES D’ADHESION D’OSTEOBLASTES ET DE FIBROBLASTES CULTIVES SUR DU NITI DE 2 RUGOSITES DIFFERENTES C. WIRTH, C. LAGNEAU, A.M. FREYRIA, D. DECORET, P. EXBRAYAT, M. LISSAC Bonjour à tous! Je suis Carine WIRTH et je vais vous présenté une partie de mon sujet de recherche effectué au Laboratoire d’Étude des Interfaces et des Biofilms en Odontologie à LYON, travail sous la direction du Dr EXBRAYAT et du Pr LISSAC. Il s’agit de l’analyse de l’expression de protéines d’adhésion de cellules ostéoblastiques et fibroblastiques, cultivés sur du Nickel-Titane de 2 rugosités différentes. http://leibo.univ-lyon1.fr

Le contexte buccal Tissus Biofilm ??? ??? ??? Matériaux 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Le contexte buccal Tissus Biofilm Cellules épithéliales Cellules fibroblastiques Cellules ostéoblastiques S. mutans Actinomyces Lactobacillus ??? ??? ??? Cette étude s’inscrit dans une des thématiques développées au laboratoire qui est l’analyse du comportement des cellules et des bactéries buccales (qui forme le biofilm) sur les matériaux implantaires. Notre étude se situe, ici, à l’interface tissus/matériaux. Matériaux Matériaux métalliques Céramiques Polymères

Matériaux implantaires : 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Matériaux implantaires : Ticp, Ti6Al4V, NiTi ? Dans notre étude, 2 états de surface  : Ra ≈ 0.07, ≈ 0.15 µm NiTi poli-miroir (NiTi 2400) NiTi rugueux (NiTi 400) Comme vous le savez, actuellement, les matériaux implantaires sont essentiellement proposés en titane commercialement pur ou en alliage à base de titane tel que le Ti-6Al-4V du fait de leurs propriétés mécaniques et de leur biocompatibilité adaptées. Dans notre étude, il nous a semblé intéressant d’exploiter les propriétés mécaniques exceptionnelles de l’alliage à mémoire de forme de l’alliage Nickel-Titane en implantologie dentaire, sous réserve (évidemment) d’une intégration biologique comparable aux biomatériaux implantaires actuels. Nous savons maintenant que les caractéristiques physiques et notamment la topographie des biomatériaux influencent la réponse biologique des tissus à leur contact. C’est pourquoi, nous avons choisi de comparer le comportement cellulaire vis-à-vis de 2 états de surface d’alliage nickel-titane: d’un coté, un état de surface « poli-miroir » au Ra, la rugosité moyenne, de 0.07 µm et de l’autre un état de surface dit « rugueux » au Ra de 0.15 µm. C. WIRTH, V. COMTE, C. LAGNEAU, P. EXBRAYAT, M.LISSAC, N. JAFFREZIC, L. PONSONNET. Nitinol surface roughness modulates in vitro cell response: a comparison between fibroblasts and osteoblasts. Materials Science and Engineering C 2005, 25 : 51-60.

Types cellulaires étudiés: Techniques utilisées : 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Types cellulaires étudiés: Cellules ostéoblastiques de calvaria de rat obtenues par digestion enzymatique Cellules fibroblastiques de gencives humaines par technique des explants Techniques utilisées : immunomarquage biochimie (SDS-PAGE, Western Blot) biologie moléculaire (extraction ARN, RT-PCR) Pour notre étude, nous avons évalué le comportement de 2 types cellulaires présents au contact de l’implant : les ostéoblastes et les fibroblastes. Les ostéoblastes sont issus de calvaria de rats obtenues par digestion enzymatique à la collagénase Et les fibroblastes sont obtenus par mise en culture de sacs péricoronaires humains sains selon la technique des explants. Quant à la méthodologie, la synthèse de protéines impliquées dans l’adhésion cellulaire a été recherchée par technique d’immunomarquage, par une technique de biochimie (extraction des protéines, SDS-PAGE, Western-Blot) et par une technique de biologie moléculaire dont je vais vous présenter les résultats.

protéine adhésive de la MEC 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Protéines étudiées : noyau substrat membrane cellulaire protéine adhésive de la MEC intégrines complexe d’adhérence cytosquelette collagène de type I fibronectine ostéocalcine ostéopontine ostéonectine Protéines adhésives de la MEC Mais avant cela, quelles sont les protéines que nous avons étudiés? Tout d’abord, 2 protéines adhésives de la MEC : le collagène de type I et la fibronectine Puis, 3 protéines qui sont des marqueurs caractéristiques du phénotype ostéoblastique au cours de l’ostéogenèse : l’OC, l’OP et l’ON Protéines spécifiques des ostéoblastes

Réaction d’amplification en chaîne = PCR 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Réaction d’amplification en chaîne = PCR Séquence cible : ADN à amplifier 5’ 3’ 3’ 5’ Taq Polymérase Amorces Pol Petit rappel sur la technique PCR: Si la séquence d’un segment d’ADN est connue, on peut l’amplifier spécifiquement in vitro par un procédé de réaction d’amplification en chaîne appelé PCR pour Polymerase Chain Reaction. Celui-ci consiste à utiliser 2 amorces d’oligonucléotides de synthèse située de part et d’autre de la séquence à amplifier et une ADN polymérase, la Taq polymérase. La PCR est constituée de plusieurs cycles, chacun comprenant 3 temps: une étape de dénaturation une étape d’hybridation une étape de polymérisation

Premier cycle : 95°C : 45 s Étape 1 : DÉNATURATION 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Premier cycle : 95°C : 45 s Étape 1 : DÉNATURATION 5’ 3’ 5’ 3’ Pour l’étape de dénaturation, la température est amenée à 95°C. A cette température, le double brin hélicoïdal qui compose la matrice d’ADN se linéarise et les deux brins se séparent.

: Tm : 1 min Étape 2 : HYBRIDATION 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy : Tm : 1 min Étape 2 : HYBRIDATION 5’ 3’ 5’ 3’ Ensuite l’étape d’hybridation; à la température adéquate Tm, les deux amorces s’hybrident de manière spécifique sur chacun des deux brins d’ADN et délimitent ainsi la séquence cible qui sera amplifiée

Étape 3 : POLYMÉRISATION 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy : 72°C : 1 min Étape 3 : POLYMÉRISATION 5’ 3’ Pol Pol 5’ 3’ La dernière étape est l’étape de polymérisation ou d’élongation. A 72°C, la Taq polymérase synthétise un brin complémentaire de chacun des deux brins originaux en partant des deux amorces.

Étape 3 : POLYMÉRISATION 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy : 72°C : 1 min Étape 3 : POLYMÉRISATION 5’ 3’ Pol Pol 5’ 3’ On obtient ainsi deux fragments d’ADN.

1er cycle 2ème cycle 3ème cycle 4ème cycle 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Et ces étapes sont répétées sur plusieurs cycles. L’amplification est exponentielle : comme vous le voyez, au bout de N cycles on obtient théoriquement 2 puissance N exemplaires du segment d’ADN. En 20 cycles la séquence initiale est en principe amplifiée un million de fois (en pratique, le rendement effectif d’amplification est de l’ordre de 70%) 1er cycle 2ème cycle 3ème cycle 4ème cycle

Résultats des électrophorèses 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Résultats des électrophorèses 400 2400 400 2400 400 2400 1000 pb ARN extraits de fibroblastes humains cultivés sur du NiTi poli-miroir et rugueux 500 400 300 200 100 GAPDH (450pb) Collagène de type I (352pb) Fibronectine (442pb) 1000 pb 400 2400 400 2400 400 2400 ARN extraits d’ostéoblastes de rat cultivés sur du NiTi poli-miroir et rugueux 500 400 300 200 100 Pour visualiser les amplifiats d’ADN obtenus avec les amorces de nos protéines étudiées, une migration électrophorétique sur un gel d’agarose a été réalisée. La révélation se fait sous UV et des photographies des gels sont réalisées. Voici les résultats que nous avons obtenus à partir d’ARN de cellules extrait après 7 jours de culture sur nos matériaux. En ce qui concerne la synthèse du collagène de type I et de la fibronectine par les fibroblastes et par les ostéoblastes: Nous ne constatons pas de différence d’intensité entre les signaux obtenus sur le NiTi poli-miroir et le NiTi rugueux. Il n’y a donc pas de différence de synthèse du collagène de type I et de la fibronectine par les cellules fibroblastiques et ostéoblastiques quel que soit l’état de surface du NiTi GAPDH (393pb) Collagène de type I (557pb) Fibronectine (351pb) Pas d’influence de la rugosité de surface sur la synthèse du collagène de type I et de la fibronectine par les ostéoblastes et les fibroblastes

Résultats des électrophorèses 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Résultats des électrophorèses 1000 pb 400 2400 400 2400 400 2400 ARN extraits d’ostéoblastes de rat cultivés sur du NiTi poli-miroir et rugueux 500 400 300 200 100 OP : ostéopontine ON : ostéonectine OC : ostéocalcine OP (688pb) ON (650pb) OC (760pb) Intensité de la bande plus importante sur le NiTi poli-miroir que le NiTi rugueux En ce qui concerne la synthèse de l’ostéopontine, de l’ostéonectine et de l’ostéocalcine par les ostéoblastes: Pour l’ostéopontine et l’ostéonectine, nous n’observons pas de différence d’intensité du signal entre les matériaux testés. Pour l’ostéocalcine, le signal est plus faible sur le NiTi rugueux que sur le NiTi poli-miroir. L’expression de l’ostéocalcine est donc influencée par l’état de surface des échantillons L’expression de l’ostéocalcine est favorisée par un état de surface poli-miroir

Conclusion & Perspectives 22ème journée scientifique du Collège Français des Biomatériaux Dentaires – 26, 27 mai 2005 - Nancy Conclusion & Perspectives NiTi avec Ra=0.07µm  bon compromis pour obtenir un comportement optimum des ostéoblastes et des fibroblastes Étude de la synthèse d’autres protéines comme des intégrines, des cytoxines, des facteurs de croissance, des marqueurs d’apoptose par biologie moléculaire En conclusion, l’état de surface poli-miroir au Ra de 0.07 µm pourrait être un bon compromis pour obtenir un comportement optimum à la fois des ostéoblastes et des fibroblastes. Resta à savoir si cette rugosité convient aussi aux cellules épithéliales, également présentes sur les sites d’implantation. Par la suite, la synthèse d’autres protéines comme des intégrines, des cytoxines, des facteurs de croissance, des marqueurs d’apoptose, serait également intéressante à évaluer par technique de biologie moléculaire.