Avant-propos sur les « CD » On désigne souvent les protéines cellulaires (notamment membranaires) sous le terme de CDn (CD1, CD2, CD3, CD4, etc.) Pourquoi?

Les anticorps monoclonaux Injection des antigènes (ou des mélanges d’antigènes) contre lesquels on veut générer des anticorps

Les anticorps monoclonaux Prélèvement du sang de la souris et fusion des lymphocytes B avec des cellules immortalisées : obtention d’hybridomes

Les anticorps monoclonaux Screening des différents clones obtenus avec les cellules utilisées pour l’immunisation

Qu’est ce qu’un CD? CD : cluster of designation nom initialement donné à l’ensemble des anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes ou les antigènes d’une même protéine présente à la surface cellulaire par extension, le CDn désigne la protéine elle-même; les anticorps étant dénommés anti-CDn

Utilisation des anticorps monoclonaux pour caratériser les sous-populations de leukocytes Inoculation de leukocytes humains à des souris Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines de membrane Utilisation conjointe du westernblot et du Facs pour définir La nature de la protéine reconnue Les sous-populations sur laquelle elle est présente

Westerblot Cytofluorimétrie

Echange d’informations et d’hybridomes lors de «workshops » Des anticorps monoclonaux différents, produits dans des labos différents reconnaissent dans certains cas la même protéine On dit alors que ces différents anticorps appartiennent au même groupe (cluster) de différenciation (CD) Chaque workshop définit ainsi les CD par ordre de description et établit pour chaque CD, les propriétés de la protéine reconnue et les cellules sur lesquelles on la trouve

Les anticorps monoclonaux Les clones A3 et B1 reconnaissent la même protéine : c’est le même CD

De l’anticorps monoclonal à la protéine Au fur et à mesure des workshops, on a utilisé le terme CD pour désigner les protéines membranaires elles-mêmes et donné le nom d’anticorps anti-CD aux monoclonaux correspondants

Immunité naturelle

Les « barrières »

Les défenses de barrière La peau et le sébum (rôle antibactérien des acides gras) Le mucus et « l’escalator muco-ciliaire » Les flores saprophytes (intestin, vagin, etc.) Colicine… Les milieux acides Protéines et peptides antimicrobiens

Les protéines et peptides antimicrobiens Produits par de multiples types cellulaires Glandes sous-muqueuses Cellules épithéliales Cellules « spécialisées » de l’immunité naturelle Polynucléaires neutrophiles Macrophages Selon les cas, intervention extracellulaire, intracellulaire (bactéries phagocytées) ou les deux

Les protéines et peptides antimicrobiens Espoir thérapeutique (cf. résistance aux antibiotiques)

Les protéines et peptides antimicrobiens Enzymes : ex. lysozyme (250-500 mg/ml dans les sécrétions nasales, salive, larmes) Lactoferrine (chélation du fer) Défensines (feuillets b) b défensines (HBD-1 et HBD-2) Peau et tractus respiratoire a défensines (=cryptidines) Cellules de Paneth de l’intestin Cathélicidines (hélices a) Protéines A et D du surfactant (opsonines primitives)

Les protéines et peptides antimicrobiens Rôle essentiel dans les défenses de première ligne Activité des défensines et des cathélicidines effondrée dans les poumons des enfants mucoviscidosiques Inhibition fréquente par hautes concentrations en sel (cf. mucoviscidose) Nouvelles approches thérapeutiques agissant sur la concentration saline du mucus Autres mécanismes?

La plupart des cellules de l’organisme participent à l’immunité naturelle La plupart des cellules sont capables de “percevoir” la présence d’un microorganisme pathogène En réponse à cette perception, elles attirent sur place des cellules plus spécialisées de l’immunité naturelle (phagocytes)

Systèmes de perception des microorganismes pathogènes « Signatures » (stéréotypes) moléculaires sur les microbes : PAMP (pathogen associated molecular patterns) Ne sont pas présents chez l’hôte Sont partagés par de grands groupes d’agents pathogènes Sont relativement peu variables (à la différences de l’hémagglutinine et de la neuraminidase p.ex.)

Exemples de PAMP (signatures) Flagelline des flagelles bactériens Peptidoglycan des bactéries à G+ Lipopolysaccharide (endotoxine) des bactéries à G- RNA double brin DNA non méthylé

Récepteurs aux PAMP = PRR Pattern recognition receptors Trois types « senseurs » membranaires ou intracellulaires Rôle dans la reconnaissance du microbe et le déclenchement de la réponse immunitaire (récepteur d’alarme) ex. Récepteurs TOLL (TLR) Sont présents sur la plupart des cellules de l’organisme « effecteurs membranaires » Déclenchent la phagocytose du microbe Uniquement présent sur les cellules « spécialisées » de l’immunité naturelle Solubles Interagissent directement avec le microbe

Récepteurs de la famille Toll Les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries Gram-, les récepteurs de la famille Toll et le CD14

Lipopolysaccharide (LPS) = endotoxine Composant du feuillet externe de la membrane des bactéries Gram- Lipide A (responsable de la toxicité) + polysaccharides Responsable du choc septique induit par les bactéries Gram – Choc septique : phénomène actif lié à la réponse de l’immunité naturelle à la toxine

Protéines Toll Protéines identifiées initialement chez les insectes (drosophiles) et impliquées à la fois dans le développement et dans la résistance à certaines infections Equivalent des protéines Toll chez les mammifères (toll like receptors) Les souris TLR4 KO ne font jamais de choc septique après injection de LPS!

des cellules phagocytaires CD14 marqueur des cellules phagocytaires

Le Toll like receptor 4 appartient au récepteur du LPS Intérêt éventuel à bloquer les signaux induits par le LPS chez les patients en choc septique

TLR et activation des phagocytes le facteur NF-kb facteur transcriptionnel pivot des réponses phagocytaires

Famille de TLR TLR-2 : protéoglycans des Gram+ TLR-3 : dsRNA TLR-4 : LPS TLR-5 : flagelline TLR-7 : ssRNA viral TLR-8 : ssRNA viral TLR-9 : CpG non méthylés du DNA Etc.

Les phagocytes 1. Polynucléaires neutrophiles (et dans une moindre mesure les polynucléaires éosinophiles) 2. Monocytes & macrophages 3. Cellules dendritiques

Hématopoïèse

1. Cellules pluripotentes Enorme capacité d’auto-renouvellement et de différenciation

Cellules pluripotentes Cellule souche myéloïde (par opposition à lymphoïde)

Cellule pluripotente Cellule souche myéloïde (par opposition à lymphoïde) Progénitrice commune aux neutrophiles et aux cellules mononucléées (mono/macro et cellules dendritiques)

Cellule pluripotente Cellule souche myéloïde (par opposition à lymphoïde) Progénitrice commune aux neutrophiles et aux cellules mononucléées (mono/macro et cellules dendritiques) Rôle des cytokines dans la différenciation : GM-CSF et G-CSF

Les polynucléaires ou granulocytes un seul noyau mais polylobé (d’où le nom polynucléaire) 60 à 70% des leucocytes sanguins turnover très élevé (durée de vie courte) classification selon le type de granules Leucocytes = globules blancs (par opposition au hématies) =lymphocytes+granulocytes+monocytes

Les polynucléaires ou granulocytes un seul noyau mais polylobé (d’où le nom polynucléaire) 60 à 70% des leucocytes sanguins turnover très élevé (durée de vie courte) classification selon le type de granules Lignée cellulaire très sensible lors des traitements de chimiothérapie chez les cancéreux ou leucémiques

Polynucléaires neutrophiles Collagénase Lactoferrine Lysozyme Lysozyme Peroxydase autres enzymes...

Polynucléaires neutrophiles ou « neutrophiles », c’est le type de polynucléaires le plus important en nombre et en fonction 1ère ligne de défense contre de nombreux types de germes tuent les microbes intracellulaires de façon plus efficace que les macrophages

Trois types cellules cellulaires souvent associés en pathologie Multiples médiateurs inflammatoires Intervention dans les phénomènes allergiques et inflammatoires Polynucléaires éosinophiles, basophiles et mastocytes

Polynucléaires éosinophiles Rôle dans la défense anti-parasitaire Multiples médiateurs de l’inflammation

Eosinophiles et inflammation

Polynucléaires basophiles

Mastocytes Cellules associées aux muqueuses, aux épithéliums et aux endothéliums (notamment veinules postcapillaires) Participent à la première ligne de défense directement (p.ex. cathélicidines) soit par attraction d’autres phagocytes (chimiotactisme)

Monocytes et macrophages

Monocytes et macrophages Sang Tissus

Macrophages Poumon : macrophages alvéolaires Tissus conjonctifs : histiocytes Rein : cellules mésangiales Foie : cellules de Küpfer Cerveau : microglie Os : ostéoclastes

Les cellules dendritiques

Les cellules dendritiques Différents dénominations selon le site et la l’état de différenciation/activation peau et muqueuses : cellules de Langerhans organes : cellules dendritiques interstitielles organes lymphoïdes : cellules dendritiques interdigitantes sang : cellules dendritiques circulantes (veiled cells)

Cellules dendritiques « Patrouillent » dans les tissus Deux fonctions différentes selon le site

Phagocytes et « présentation d’antigène » Polynucléaires neutrophiles, macrophages et cellules dendritiques sont trois types de phagocytes Les cellules dendritiques et les macrophages sont CMH II pas les polynucléaires neutrophiles donc pas de rôle des neutrophiles dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T CD4 Les cellules dendritiques sont les plus efficaces cellules présentatrices d’antigènes aux lymphocytes T CD4+ Ne confondez pas cellules dendritiques et cellules folliculaires dendritiques (CMH II négatives et non présentatrices d’antigènes sensu stricto)

Macrophages et cellules dendritiques possèdent la protéine CD4 Rôle? La présence de la molécule CD4 rend les macrophages et les cellules dendritiques susceptibles à l’infection par le VIH

Les récepteurs des phagocytes Trois grands types de récepteurs récepteurs pour des produits microbiens récepteurs pour des facteurs humoraux ou cellulaires qui facilitent la phagocytose récepteurs pour des ligands qui activent ou orientent les déplacements des cellules phagocytaires vers les sites inflammatoires

Immunité non adaptative Reconnaissance de PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns Structures moléculaires hautement conservées et présentes dans de larges groupes de microorganismes = stéréotypes moléculaires associés aux pathogènes

Récepteurs aux produits microbiens (pattern recognition receptors PRP) Le récepteur au mannose (MR ou M/FR) et sa famille

Le récepteur au mannose et sa famille Domaine de type lectine (site de la liaison au résidus mannosyl et fucosyl)

Lectines protéines ou glycoprotéines capable de se lier à certains résidus glucidiques origine non immunitaire capable comme un anticorps d’agglutiner ou de précipiter des cellules ou des glycoconjugués isolées initialement chez des végétaux mais molécules voisines (lectin-like) présentes chez les bactéries et les animaux

Le récepteur au mannose et sa famille Domaine de type lectine (site de la liaison au résidus mannosyl et fucosyl) Liaison à de nombreux microorganismes Gram-, Gram+, mycobactéries, champignons, parasites

Récepteur f-Met-Leu-Phe Récepteurs pour peptides N-formylés de nombreuses bactéries Récepteur chimiotactique

Récepteurs aux PAMP avec propriétés différentes Récepteur au mannose : phagocytose Récepteurs Toll : signal d’activation Récepteur FMLP : chimiotactisme

Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire Opsonines-opsonisation opsonein : je prépare le repas Facilitation de la phagocytose des microorganismes par des produits humoraux de la réponse immunitaire (immunoglobulines ou fragments du complément activé)

Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire Récepteurs pour l’extrémité Fc (cristallisable ou constant) des immunoglobulines Portion Fc

Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire Récepteurs pour l’extrémité Fc des immunoglobulines Selon la classe d’immunoglobuline reconnue (IgG, ou IgE), les récepteurs (FcgR, FceR) ont des structures et des distributions cellulaires différentes

Récepteurs pour des facteurs humoraux de la réponse immunitaire Récepeurs pour des fragments du complément activé CR1 CR3

Le processus de phagocytose Quatre étapes chémotactisme adhésion phagocytose (sensu stricto) microbicidie oxydative non-oxydative

Phagocytose Phénomène actif et consommateur d’énergie Efficacité accrue par l’opsonisation

Microbicidie (ou bactéricidie) intracellulaire Deux mécanismes différents phénomènes oxydatifs dépend de la production d’intermédiaires réactifs de l’oxygène qui ont un rôle microbicide phénomène inductible : « explosion respiratoire » phénomènes non oxydatifs dépend de la production de peptides antibactériens

Microbicidie oxydative Myélopéroxydase NO synthase NADPH oxydase

Microbicidie oxydative Dépendance du NADPH fourni par le shunt des pentoses

Microbicidie oxydative NO : nombreuses fonctions indépendantes de son rôle microbicide

Microbicidie oxydative Phénomènes qui consomment beaucoup d’énergie et sont donc sensibles aux maladies où l’apport cellulaire en énergie est perturbé : diabète mal équilibré Dans certaines maladies génétiques, une des trois enzymes est déficiente : les germes prolifèrent à l’intérieur des phagocytes, ce sont les maladies granulomateuses chroniques

Microbicidie oxydative Phénomènes qui consomment beaucoup d’énergie et sont donc sensibles aux maladies où l’apport cellulaire en énergie est perturbé : diabète mal équilibré Dans certaines maladies génétiques, une des trois enzymes est déficiente : les germes prolifèrent à l’intérieur des phagocytes, ce sont les maladies granulomateuses chroniques

Microbicidie oxydative A l’état de repos, les macrophages et monocytes sont généralement moins efficaces que les polynucléaires neutrophiles pour la microbicidie oxydative et dépendent étroitement de l’aide des lymphocytes T

Microbicidie non oxydative existent aussi souvent dans les sécrétions Enzymes microbicides Hydrolases : lysozyme (muramidase) : destruction de la paroi bactérienne des G+; glycosidases, lactoferrine, élastase, cathepsines Protéines cationiques : « protéines antibiotiques » défensines : petites molécules (29-35 aa) possédant trois ponts disulfures et dont l’activité est inhibée quand la concentration en sels (Cl-) est trop élevée

Exocytose processus alternatif mis en place par les macrophages et les polynucléaires neutrophiles quand la phagocytose est impossible moins sélective moins efficace processus principal d’autres types cellulaires comme les polynucléaires éosinophiles et basophiles

Polynucléaires éosinophiles

Polynucléaires éosinophiles Dégranulation : produits à activité antiparasitaire IgE FceR

Cytotoxicité (à médiation cellulaire) Lymphocytes T cytotoxiques CD8+ Cellules tueuses naturelles (natural killer ou NK) Cellules K et phénomène ADCC

Lymphocyte T cytotoxique (CD8+) Polarisation et exocytose dépendent d’un accroissement du [Ca++] i dans le lympho. cytotoxique

Deux constituants dans les granules Perforines forment des trous dans la membrane de la cellule cible (comme le complément) Sérine Protéases (granzymes)

Perforines des lymphocytes T cytotoxiques

Deux voies d’induction de l’apoptose de la cellule cible

Deux voies d’induction de l’apoptose de la cellule cible A la différence des autres lymphocytes les lymphocytes T cytotoxiques activés expriment le Fas ligand

Lymphocyte T cytotoxique 1. Il entre en contact avec sa cible 2. La reconnaissance spécifique de l’antigène + MHC I déclenche un accroissement du calcium intracellulaire 3. Les granules se polarisent puis se vident à l’interface avec la cellule cible 4. Les monomères de perforine se polymérisent et forment des trous dans la cellule cible 5. Les sérines protéases (granzymes) entrent par ces trous et en synergie avec l’interactions Fas/Fas ligand déclenchent l’apoptose de la cellule cible

Lymphocyte T cytotoxique Le lymphocyte cytotoxique ne tue pas la cellule cible, il la contraint surtout à se suicider...

Les cellules tueuses naturelles (NK)

Les cellules tueuses naturelles Toujours prêtes : pas besoin de sensibilisation, ni de différenciation préalables... Mécanismes lytiques (perforines et granzymes) les mêmes que ceux des lymphocytes T cytotoxiques

Cellules NK Cellules de la lignée lymphoïde mais qui ne sont ni B (pas d’Ig de membrane ou cytoplasmique) ni T (pas de TCR)

Quel type de cellules reconnaissent les NK? Cellules infectées Cellules tumorales Parasites

Comment ça marche?

Base moléculaire de la discrimination par les cellules NK comment reconnaître une cellule transformée ou infectée par un virus quand on n’a pas de TCR? première piste : la cellule NK reconnaît une sorte de PAMP à la surface de ces cellules... 20 ans de recherche, jamais rien trouvé de tel!

Base moléculaire de la discrimination par les cellules NK comment reconnaître une cellule transformée ou infectée par un virus quand on n’a pas de TCR? deuxième piste : la cellule NK perçoit l’absence d’une structure normalement présente sur les cellules de l’organisme

Les récepteurs KIR (Killer Inhibitory Receptors)

La perte des molécules MHC est un moyen fréquemment utilisé par les cellules tumorales ou par les cellules infectées par des virus pour échapper au contrôle des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ ...

cela rend les cellules en question plus sensibles à l’activité des NK cela rend les cellules en question plus sensibles à l’activité des NK. L’évolution a conservé les NK aux côtés des lymphocytes T cytotoxiques pour contrecarrer les mécanismes d’échappement des virus...

« Cellules K » et ADCC ADCC = antibody dependent cell-mediated cytotoxicity

« Cellules K » et ADCC ADCC = antibody dependent cell-mediated cytotoxicity Les cellules K correspondent à une fonction particulière que peuvent exercer plusieurs types cellulaires (NK, macrophages, polynucléaires) Les cellules K ne sont pas une lignée en soi

Conclusion Immunité naturelle Première ligne de défense contre les agents infectieux Rôle fondamental dans l’initiation des réponses adaptatives Réponses peu ciblées, stéréotypées Inflammation

Inflammation L’inflammation est souvent le reflet d’une activation de l’immunité naturelle