Énumération des Microorganismes

Énumération des Microorganismes Abondance relative Mesures de turbidité Comptes directs Comptes absolus Comptes viables Nombre absolu des bactéries en croissance Nombre le plus probable (NPP) Nombre probable de bactéries avec des caractéristiques données

Mesure de la Turbidité  Mesure la quantité de lumière qui peut traverser un échantillon Le moins de lumière qui traverse l’échantillon le plus dense est la population Mesure la densité optique ou le pourcentage de transmission

Mesure de la Turbidité Spectrophotomètre (A600): Mesure de la Densité Optique (D.O.) Lumière 600nm Détecteur…. lecture Lecture différente

2.0 1.0 D.O. 600nm % Transmission 100 50 Densité cellulaire

Avantages: Désavantages: Rapide Mesure relative Ne distingue pas vivant de mort Ne distingue pas bactéries de détritus Ne distingue pas entre différents types de microbes

Problème Deux bouillon de culture possède la même densité optique. Un bouillon représente un grand bacille (A) tandis que l’autre est un petit bacille (B). Que pouvez vous conclure?

Comptes Directs L’échantillon à être énuméré est appliqué à une lame d’hématimètre qui retient un volume fixe dans une cellule de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

Hématimètre Cette lame possède 2 cellules de comptages indépendantes

Déterminer le Compte Direct Compter le nb de cellules dans 3 carrés 8, 8 et 5 Faire la moyenne (8 + 8 + 5)/3 =7 Donc 7 cellules/carré

Déterminer le Compte Direct 1mm Profondeur: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nb moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

Avantages: Désavantages: Rapide Culture pas nécessaire Aucune info préalable nécessaire Désavantages: Ne distingue pas vivant de mort Difficile de distinguer bactéries de détritus

Problème Un échantillon est appliqué à une lame d’hématimètre dont les cellules de comptages ont les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm et qui possèdent 100 carrés. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quel est le volume d’une cellule de comptage? Quel est le volume d’un carré? Quel est le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon?

Solution Volume d’une cellule de comptage? Volume d’un carré? 0.01 X 0.01 X 0.002cm = 2 X 10-7cc ou mL Volume d’un carré? 2 X 10-7mL/100 carrés = 2 X 10-9mL Nombre de cellules par millilitre? Nb moyen de cellules/carré = 4 Donc 4 cellules/2 X 10-9mL = 2 X 109 cellules/mL

Problème Un échantillon qui contient 109 cellules/mL est appliqué à une lame d’hématimètre dont les cellules de comptages ont les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.2mm X 0.1mm et qui possèdent 50 carrés. Combien de cellules en moyennes sont attendus/carré?

Solution Volume d’une cellule de comptage? Volume d’un carré? 0.01 X 0.02 X 0.01cm = 2 X 10-6cc ou mL Volume d’un carré? 2 X 10-6mL/50 carrés = 4 X 10-8mL Nombre de cellules pour un carré? 109 cellules/mL X 4 X 10-8mL = 40 cellules

Comptes Viables Cellule viable: cellule capable de se diviser et de générer une population (ou colonie) Un compte viable est fait en diluant l’échantillon original Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu de culture approprié Incuber sous les conditions appropriées pour permettre la croissance Des colonies sont formées Les colonies sont comptées et le nombre original de cellules viables est déterminé en fonction de la dilution

Dilutions d’un Échantillon de Bactéries

Dilutions d’un Échantillon de Bactéries

Dilutions d’un Échantillon de Bactéries

Dilutions d’un Échantillon de Bactéries

Dilutions d’un Échantillon de Bactéries 5672 57 4

Comptes Viables  Le nombre total de cellules viables est indiqué en tant qu’Unité Formatrice de Colonie (UFC) plutôt que nombre de cellule Chaque colonie est originaire d’une unité formatrice de colonie (UFC) Une plaque avec 30-300 colonies est choisie (Nombre de colonies sur la plaque ) ÷ le volume étalé ÷ la dilution = Nombre d’UFC/mL Ex. 57 UFC ÷ 0.1 ÷ 10-5 = 5.7 X 107 UFC/mL

Avantages: Désavantages: Dénombre les microorganismes viables Peut distinguer différents microorganismes Désavantages: Pas de milieu universel Nécessite la croissance du microorganisme Seulement les cellules vivantes génèrent des colonies Des amas ou des chaînes de cellules génèrent une seule colonie

Problème Des bouillons d’E.coli et de Micrococcus luteus qui contiennent 109 cellules/mL ont été dilué par 10-6. 0.2mL ont ensuite été étalé. Combien d’UFC sont attendus dans chaque cas? E.coli: 109 X 10-6 X 0.2mL = 200 UFC M. luteus: (tétrad; donc 1 UFC = 4 cellules) (109 X 10-6 X 0.2mL)/4 = 50 UFC

Nombre le Plus Probable: NPP Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé, chacune dans 3 tubes -1 -2 -3 -4 -5 -6 Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période d’incubation appropriée, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la CROISSANCE et les caractéristiques désirées)

NPP (Suite) L’objectif est de DILUER l’organisme à zero Après incubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées est enregistré Exemple de résultats pour une suspension de 1g de terre /10 ml Dilutions: -3 -4 -5 -6 Tubes positifs: 3 2 1 0 Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau

NPP (Suite) Combinaison choisie: 321 Multiplier NPP par le facteur de dilution central 150 X 104 = 1.5 X 106 bactéries/mL Ou 1.5 X 106 bactéries/0.1g de terre Donc 1.5 X 107 bactéries/g Tubes Pos. NPP/g (mL) 0.1 0.01 0.001 3 2 1 150

Question Quelle méthode serait la plus rapide et la plus précise pour déterminer le nombre de bactéries dans chacun des cas suivants? Nombre de bactéries dans un lac Nombre d’E. coli dans 100g de bœuf Comparer la densité cellulaire entre deux cultures de B. subtilis Déterminer le nombre d’Escherichia et de Lactobacillus dans 100mL de lait