EPIGENETIKA – ALHEMIJA MEDICINE 21. VEKA Doc. dr sci biol. Gordana Šupić, molekularni biolog i fiziolog Medicinski fakultet Vojnomedicinske akademije, Institut za medicinska istraživanja, VMA, Beograd

EPIGENETIKA Nasledne promene genske ekspresije, bez promene primarne nukleotidne sekvence D NK; Supic et al, 2016 Lujambio, et al, 2007 Bachman et al, 2003 DNK metilacija Martens et al, 2005 Modifikacije histona (acetilacija, metilacija, fosforilacija…); ”histonski kod” RNA interference – RNAi, post-transkripcionalno utišavanje gena, (RNA silencing) (dsRNA, siRNA, miRNA, stRNA, shRNA)

Metilacija DNK - održavanje gena u transkripciono inaktivnom stanju DNMT DNK metil transferaza, DNMT S-adenozil metionin, SAM Metilentetrahidrofolat reduktaza, MTHFR SAM MTHFR CH3 CpG Metil-CITOZIN CpG CITOZIN Folat KANCER ostrvaca, – Metilacija CpG regiona sa velikim brojem CpG dinukleotida (>60%), unutar promotora tumor supresorskih utišavanja transkripcije gena dovodi do i gašenja njihove

DNK metilacija DNK metil transferaze (DNMT1, 3A, 3B), enzimi koji vrše metilaciju DNK DNMTs koordinišu transkripcionalno utišavanje ili gašenje zajedno sa metil- vezujućim proteinima i enzimima koji modifikuju histone

CpG metilacija CA HAT Normalna ćel. Ćel. tumora Metilovani CpG Normalna ćel. Nemetilovani CpG Deacetilaza histona Metil. K4 na H3 HDAC MBP MBP Metil. K9 na H3 HDAC Represorni kompleks (SIN3) Korepresor SIN3 HDAC Kompleks aktivacije transkripcije Ćel. tumora Nukleozom sa deacet. histonima Nukleozom sa metil. histonima HP1α hromodomen protein Histonska metiltransferaza MBP HDAC HDAC Kompleks aktivacije transkripcije TF CA HAT transkripcioni factor (TF), koaktivator (CA), histonska acetiltransferaza (HAT) Kompleks aktivacije transkripcije

MODIFIKACIJE HISTONA – HISTONSKI KOD Histoni – dinamička uloga u regulaciji hromatina i genske aktivnosti Acetilatilacija, metilacija, fosforilacija, ubikvitinizacija… Acetilacija histona (HAT) dodavanje acetil grupa, hromatin dostupan transkripcionim faktorima. Histon deacetilaze (HDAC) deacetiliraju histone, nukleozomi su gusto pakovani, hromatin je inaktivan. Metilacija histona ne menja naelektrisanje histona, već utiče na hemijske reakcije histona i njihov afinitet za transkripcione faktore. Lysine (K) Modified from Ver - - - - - - + + + + + + + + + + - - + - + + - - - tino, Stewart, 2003

RNA interferenca – RNA silencing Non-coding RNAs (siRNA, miRNA, stRNA, shRNA, ALU, LTR, LINE) Micro-RNAs (miRNAs) >2000, 18-22 nukleotida, post-transkriptionalna regulacija genske ekspresije partial base pairing complete complimentary base pairing Supic et al, 2013

ODLIKE EPIGENETSKIH PROMENA Epigenetske promene se dešavaju mnogo češće od genetskih promena u DNK sekvenci. Epigenetske promene su mnogo brže evolutivne promene od mutacija, što omogućava brze odgovore na promene spoljašnje sredine. Epigeneske promene su veoma senzitivne i na male doze štetnih agenasa spoljašnje sredine, zavise od doza, ali i od faze razvića u kojoj se desilo izlaganje. Epigenetske promene su potencijalno reverzibilne dok su mutacije ireveryibilne, što omogućava razvoj epigenetske terapije ili hemoprevencije bioaktivnim komponentama hrane. Epigenetske promene su tkivno-specifične i mogu se razlikovati od tipa ćelije unutar istg organizma. Epigenetske promene su i karakteristične za vrstu (species specifične), pa kancerogeni ili toksični efekti dobijeni na laboratorijskim životinjama (glodarima) ne moraju biti isti kao i kod ljudi.

La Cathédrale de Rouen, le portail et la tour Saint-Romain Claude Monet

La Cathédrale de Rouen, le portail et la tour Saint-Romain Claude Monet Effet du Plein soleil, matin midi Après-midi Coucher du soleil

Metilacija DNK - održava gene u transkripciono inaktivnom stanju Stabilnost genoma - Inaktivacija repetitivnih elemenata, viralnih sekvenci, transpozona Diferencijacija ćelija tokom razvića Izjednačavanje genske doze između ženskog i muškog pola - Inaktivacija jednog X hromozoma kod ženskog pola Genomski otisak - Imprinting (IGF2, Prader-Willi/Angelman sindrom) Fenotipska varijabilnost monozigotnih blizanaca Starenje KANCER

METILACIJA KOD KANCERA METILACIONI PARADOKS – globalna hipometilacija vs. regionalna hipermetilacija Ehrlich et al, 2002

INAKTIVACIJA TUMOR SUPRESORSKIH GENA HIPERMETILACIJOM Sporadični kanceri Nasledni kanceri Mutacija Hipermetilacija KNUDSON “TWO-HIT” MODEL, 1971 Aktivnost MODEL HAPLOINSUFICIJENCIJE, 2005 Aktivnost Genska doza Genska doza

Chen et al, 2011

DNK METILACIJA I RANA DETEKCIJA KANCERA Poremećaji metilacije su mnogo češći i lakši za detekciju u ondosu na mutacije Herman, Baylin, 2003 ••pM1e6ti,lMacGioMnoT-supespciufitčunmi PuCpRr(isMuStPn)a–i dmoo3gu5ćme dperteekmtoavnaitfie1stuac5i0je0k0a0rcćienl.oma p(lHuećrma!a(nBeetlianls, k1y99et6,aPl,a1l9m9i8sa, Pnoalmetiasal,n2o00et0);al,R20e0a0l-)Time MSP ••ANPeCinvai GzSivTnPi1teustuorviin: kurmv, asrekruermk, aspnucteurma p, brorosntahtoea,lsvaeovliasronkaolmavaža, urin… senzitivnošću/specifičnošću: 92% / 86% (Caims et al, 2001).

COLOGUARD – Avgust 2014. FDA odobrila prvi neinvazivni Screening Test za kolorektalni karcinom dizajniran da se analizira stolica pacijenata na prisustvo 11 molekularnih markera koji se zasniva na DNK metilaciji (NDRG4, BMP3), mutaciji (K-ras), i eseju na prisustvo hemoglobina. 10 000 pacijenata uključeno u inicijalnu studiju, New England Journal of Medicine, 2014.

PROGNOZA Hipermetilacija DAPK gena - agresivnost tumora i loša prognoza karcinoma pluća (Inbal et al, 1999) Hipermetilacija DAPK u patohistološki negativnim marginama oralnih Ca dovedena u vezu sa značajno manjim preživljavanjem pacijenata (Supic et al, 2011) Hipermetilacija E-kadherina (CDH1) – marker lošeg ishoda u velikom broju karcinoma (Chen et al, 2008, Supic et al, 2009) – dinamičke promene u metilaciji su neophodni za invaziju i metastaziranje karcinoma! CpG Methylator Phenotype (CIMP) - Multipla metilacija, uz mikrosatelitnu nestabilnost i hipermetilaciju hMLH1, daje lošu prognozu kod kolorektalnih karcinoma (Issa, 2004), za razliku od oralnih karcinoma, gde je CIMP marker manje agresivnih tumora (Shaw et al, 2007). Povećana ekspresije DNMTs je dovedena u vezu sa lošom prognozom velikog broja karcinoma, uključujući i karcinom dojke (Girault et al, 2003) i oralnog karcinoma (Supic et al, unpublished data). Povećana ekspresije HDAC je dovedena u vezu sa smanjenim preživljavanjem kod karcinoma prostate, dojke i želuca (Mehnert et al, 2007, Kurdistani et al, 2007).

miRNA I PROGNOZA Negrini et al, 2007

PREDIKCIJA (PREDVIĐANJE ODGOVORA NA TERAPIJU) o Hipermetilacija O6MGMT, gen koji učestvuje u reparaciji DNK, marker dobrog odgovora na terapiju: Temozolomid kod glioma (Paz et al, 2004) - Pacijenti sa metilacijom MGMT – preživljavanje 21.7 m (15.3 m bez temozolomida); Pacijenti bez metilacije MGMT - preživljavanje12.7 m (11.8 m bez terapije temozolomidom). Karmustin kod glioma (Esteller et al, 2001). Ciclofosfamid kod B ćel. limfoma (Esteller et al, 2002); Stečena rezistencija ćelija melanoma na alkilirajuću terapiju se razvija zbog reaktivacije MGMT gena (Christmann et al, 2001). fotemustinom Hipermetilacija WRN – Irinotekan – CRC (Agrelo et al, 2006) PERSONALIZOVANA HEMIOTERAPIJA, FARMAKOEPIGENOMIKA

EPIGENETSKA TERAPIJA KANCERA DNMT INHIBITORI Nukleozidni DNMT inhibitori – ugrađuju se u DNK i postaju ‘suicidni’ supstrat za enzim DNMT; ••N5o-anz-ancuiktildeionzi(dVnidi azDa)N,MFDTA oidnohbibriiltaozrai m-ijeloEdpiisgpallalsotcičantei csihnidnr-o3m-ga(MllaDtSe) i a(kEuGtCnGu), PmOijLeIlFoEidNnOuLleIuZkZeEmLiEjuN;O5G-aČzAaJA-2!-dezoksicitidin (Decitabin) - u upotrebi >40 god (1977), 2007 FDA  za MDS Magic, Supic, 2009

EPIGENETSKA TERAPIJA KANCERA HDAC INHIBITORI - sinergistički efekat sa DNMT inhibitorima;  T ćel. Limfom kože) SAHA (2006 FDA Magic, Supic, 2009

EPIGENETIC THERAPY Mali broj registrovanih agenasa koji se koriste kao epigenetska terapija, perspektiva otkiće novih agenasa, sintetičkih ili prirodnih New purpose of old drugs – za oko 1% lekova koje je FDA već odobrila je pokazano da imaju epigenetski efekat i antineoplastičnu aktivnost (Raynard et al, 2014).

Epigenetika - karika koja nedostaje u odnosu spoljašnje sredine, genotipa i fenotipa STABILNOST STATIČNOST DINAMIČNOST FLEKSIBILNOST

PČELE! Ishrana fenotip pčela MATIČNIM MLEČOM određuje indukcijom epigenetskih Science 2008;319:1827 modifikacija

Agouti pacovi – od ishrane majke tokom gestacijskog perioda zavisi da li će transpozon u promotoru agouti gena biti metilovan i da li će taj gen biti aktivan Žuti agouti – gen aktivan, gojazni, visok % dijabetesa i karcinoma

‘Dutch Hunger Winter’ Zime 1944. Nemci blokirali transport hrane u Dansku i Holandiju Kod 4.5 miliona unos kalorija pao na oko 500 kCal/dnevno. Deca koja su u tom periodu bila začeta rađana sa malom telesnom težinom, niski, sa visokim procentom obolelih od dijabetesa, depresije i karcinoma u adultnom periodu izložene ’’gladnoj zimi’’ tokom detinstva i adoles eni rizik od nastanka kolorektalnog karcinoma, viso acije (CIMP), što je dovedeno u vezu sa polimorfizmi vuju u metabolizmu folata odn. metil grupe (MTHFR, M koje su bile izložene u prenatalnom periodu su aciju i povećanu aktivnost gena Insulin-like Growth Fac i do nastanka karcinoma debelog creva, fenomen a kasnije. Dutch Famine Birth Cohort studija je pokazala da s začeta nakon 20-30 godina, imala povišen rizik z noma debelog creva i dojke Osobe smanj metil učest Osobe metil dovod godin The žena, karci cencije su imale k % multigenske ma u genima koji S) imale nižu DNK tor 2 (IGF2), koji uočen čak i 60 u deca preživelih a oboljevanje od

Velika glad u Overkalix-u, Švedska, u 19 Velika glad u Overkalix-u, Švedska, u 19. veku – Unuci muškaraca koji su bili izloženi gladovanju tokom perioda pre adolescencije (8-12g) imaju smanjen mortalitet od kardiovaskularnih bolesti i dijabetesa (Pembrey et al., 2006); Izloženost ekstremno smanjenoj ishrani je uticala na duži životni vek unuka istog pola In utero sredina, izloženost fetusa različitim faktorima spoljašnje sredine tokom razvića može dovesti do direktnih epigenetskih promena, te potomstvo može biti podložno kompleksnim bolestima, uključujući kardiovaskularne, dijabetes, kancer i smanjen životni vek.

Epigenetika, polutanti, pušenje i trudnoća Duvanski dim, kao i drugi štetni agensi spoljašnje sredine, kao što su alkohol, pušenje i neki lekovi, mogu imati direktne efekte na epigenetske modifikacije kod fetusa, ali i na treću generaciju. Izloženost roditelja duvanskom dimu tokom perioda začeća i tokom trudnoće je dovedeno u vezu sa značajno povećanim rizikom od nastanka hepatoblastoma i leukemije kod potomaka (Secretan et al., 2009)

Izlaganje pacova fungicidu vinklozolinu, dovodi do velikog broja patoloških promena, abnormalnosti spermatozoida, infertilitet, karcinom dojke i oboljenja bubrega, koje opstaju čak i do četvrte generacije! Dietilstilbestrol (DES), lek korišćen od 40-ih do ranih 70-tih za sprečavanje spontanih pobačaja, je dovodio do epigenetskih promena i povećavao rizik od reproduktivnih poremećaja i retkih oblika kancera kod ćerki i kod unuka Uslovi spošnje sredine tokom ranog razvića su ključni za formiranje i održavanje epigenetskih promena koje se održavaju tokom celog života i mogu uticati na povećanje rizika od kompleksnih oboljenja, kao što su dijabetes, kardiovaskularna oboljenja, kancer...

EPIGENETIKA – ZAŠTO VAŠA SUDBINA NIJE ZAPISANA U VAŠOJ DNK… Vaši životni izbori mogu uticati na aktivnost vaših gena, te promene se mogu odraziti i na vašu decu i unuke, ali možete učiniti mnogo za svoju i sudbinu svog potomstva…

PIMA INDIJANCI I DIJABETES Pima indijanci koji živeu rezervatu Gila River u Arizoni imaju najveću učestalost pojave dijabetesa na svetu, dok pripadnici istog plemena koji žive u Maycoba, u Meeksiku, veoma retko oboljevaju – razlike u ishrani i načinu života (Schultz et al, )

Inactivation of gene expression Folate Selenium EGCG Caffeic and Chlorogenic acid Curcumin Quercetin Apigenin Genistein Sulforaphane Resveratrol Boswellic acids Inactivation of gene expression M M M M DNMTs M M Garcinol Curcumin M HAT HMTs, HDMs HDACs EGCG Curcumin Flavopiridol Quercetin Apigenin Genistein Diallyl disulfide Allyl mercaptan Sulforaphane Butyrate Resveratrol Vitamin D3 Arctigenin Methyl- deficient diet Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Activation of gene expression DNA Methylation Histone Acethylation M Ac Inhibition Supic et al, 2016

Meeran et al, 2010

Meeran et al, 2010

Genistein iz soje & karcinom dojke na modelu pacova: Timing is Everything! Period izloženosti Tumori/Pacov Nema Prenatal Adultni Prepubertet Prepubertet + Adultni 8.9 8.8 8.2 4.3 2.8 La Martiniere et al, 2002

Genistein iz soje & karcinom dojke kod čoveka: Timing is Everything! Li et al, 2014

„Mnogo je važnije znati kakav je čovek koji je oboleo nego kakva je bolest od koje je oboleo“ Hippocrates, 400 g. PNE ‘’Neka hrana bude tvoj lek, a lek tvoja hrana’’ Hippocrates, 400 g. PNE „U budućnosti, doktori neće više lečiti ljude lekovima, već će lečiti i sprečavati bolesti hranom“ Thomas Edison HVALA!