Méthodes d’étude des virus et de diagnostic virologique Chapitre 9 du cours de Virologie Générale MATIERE D’EXAMEN Attention : matière d’examen pour janvier
Objectifs Vous disposez de deux heures pour : Evoluer dans ce diaporama relatif au chapitre 9 du cours de virologie générale Visionner les films relatifs à plusieurs méthodes définis par l’assistante Les questions pourront être posées lors des jours suivants de TP
9.1 La culture de cellules Intérêt en virologie : production de virus en laboratoire Les différents types de cultures cellulaires Culture de cellules primaires : cellules mises en culture à partir de l’organe prélevé chez l’animal (souvent un fœtus), utilisées dès la 1ère culture. Lignée diploïde : nombre de chromosomes constant, durée de vie limitée (cellules meurent après un certain nombre de divisions) Lignée continue : transformées in vitro ou provenant de tumeurs, aneuploïdes, durée de vie illimitée Pour pouvoir multiplier les virus au laboratoire ou dans les industries, la culture de cellules est indispensable. Milieu de culture : liquide, riche en acides aminés, minéraux, tampon pH, source d’énergie, facteurs de croissance, facteurs d’attachement.
La culture de cellules Cellules adhérentes : Cellules non adhérentes : 2 types de morphologies : épithéliale (polygonale) et fibroblastique (étiré). Cellules non adhérentes : Flottent dans le milieu de culture Sphériques Destinées à la production cellulaire en masse. Les cellules peuvent être adhérentes et adopter deux types de morphologie. Si elles sont non adhérentes, elles ont alors une forme sphérique.
Les cellules Vous voyez ici un tapis cellulaire confluent. Ces cellules sont adhérentes (sur le fond du support) et de type polygonales.
Les supports Ici sont illustrés différents supports (boites en plastique) pour les cultures de cellules. Le liquide que vous observez, de couleur rouge-orange, est le milieu de culture qui apporte aux cellules les nutriments, contient des facteurs d’attachement et un indicateur de pH.
Supports de cultures cellulaires Vous voyez ici la variation de coloration du milieu en fonction du pH, ce qui vous donne en un coup d’œil une idée de la "qualité"de votre culture. Au départ, le milieu est rouge-orange (à gauche). Si il devient jaune (acidification du milieu), cela est typique lors de contamination du milieu par des bactéries ou des levures. Si il vire au rose (à droite), c’est l’évolution normale car avec le temps, le milieu devient basique. L’atmosphère riche en CO2 dans l’étuve permet que le milieu soit tamponné.
Supports de cultures cellulaires Pour des applications bien précises comme l’ELISA ou la détermination de la concentration en particules virales infectieuses par la méthode des plages de lyse ou de la DICC50, différents types de support existent. Plaque de 6 puits Plaque de 96 puits
La notion du passage cellulaire Vous disposez d’un film à visionner qui vous détaille cette manipulation.
9.2 Dénombrement des particules virales Définitions : Particules physiques = infectieuses + non infectieuses Particules infectieuses = particules dénombrées par la méthode des plages de lyse ou de la méthode des DICC50 Méthode des plages de lyse Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules Dénombrement de particules physiques
Effet cytopathogène Pour pouvoir utiliser ces deux méthodes de dénombrement, il faut que le virus possède un effet cytopathogène en culture de cellules, ce qui vous est illustré ici. Vous voyez des zones de destruction dans le tapis cellulaire par la lyse des cellules infectées par le virus. C’est sur cet effet que repose le dénombrement des particules virales infectieuses par les deux méthodes : celle des plages de lyse et celle de la DICC50.
Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses ND 10-1 10-2 10-3 10-4 T- 200 µl / puits Vous disposez d’un film qui vous détaille la manipulation du dénombrement des particules virales infectieuses par la méthode des plages de lyse. Concentration virale de départ (non diluée) ?
Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses ND 10-1 10-2 10-3 10-4 T- 2 9 7 7 Vous pourrez vous exercer lors des TP, ceci est un exemple. Moyenne de 6,25 Plages de lyse à la dilution 10-3 La concentration virale de départ est de 3,1 104 UFP / ml.
Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules (DICC 50) On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des supports de cellulles montrent un effet cytopathogène (cette dilution est celle dont le volume contient une DICC50).
Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 DICC 50 50 µl par puits Le principe est identique à celui de la méthode des plages de lyse mais ici aucun procédé n’empêche l’infection de l’entièreté tapis cellulaire au niveau d’un puit. Les puits transparents correspondent à ceux où le tapis cellulaire a été détruit par du virus et les puits colorés en mauve représentent les puis où le tapis cellulaire est resté intact et donc où il n’y avait pas de virus présent. Les dilutions sont distribuées dans chaque rangée, 50 µl de suspension par puis comme indiqué en rouge.
Nbre d’infectés/ Nbre d’inoculés Dilution virale Nbre d’infectés/ Nbre d’inoculés Nbre Nbre d’infectés de non infectés Somme I non I % d’infectés 10-2 10/10 10 0 37 0 100 10-3 27 0 10-4 17 0 10-5 6/10 6 4 7 4 64 10-6 1/10 1 9 1 13 7 10-7 0/10 0 10 0 23 10-8 0 33 10-9 0 43 Pratiquement, vous réalisez ce tableau pour pouvoir déterminer où se situe les “50% de puits infectés”. Vous voyez qu’il se situe entre 64% et 7%, donc entre la dilution 10-5 et 10-6. Par le calcul de distance proportionnelle, vous déterminez la dilution précise qui contient une DICC50 dans 50µl (quantité déposée dans chaque puis). Par application de deux produits en croix ou règles de trois, vous obtenez le nombre de DICC50 par ml contenues dans la suspension virale non diluée. Vous ferez des exercices lors des TP, ceci est un exemple. Le point d’infectivité à 50 % se situe entre 10-5 et 10-6 : (64-50) / (64-7) = 0.25 Cela signifie que 50 µl d’une dilution à 10-5,25 contient 1 DICC50, donc, le titre de la suspension virale 1/10-5,25 X 1000/50 = 3,6 .106 DICC50 / ml
Particules physiques enveloppées Particules physiques non enveloppées Dénombrement des particules physiques - Microscopie électronique Particules physiques : microscopie électronique Cette méthode ne permet pas de faire la distinction entre des particules virales infectieuses et non-infectieuses. Vous comptez des particules "physiques“. Particules physiques enveloppées Particules physiques non enveloppées
Récapitulatif : 9.2 Dénombrement des particules virales Particules infectieuses : 2 méthodes - Plages de lyse - DICC50 Particules physiques : Microscopie électronique
9.3 Purification des virus Par centrifugation : 1.Centrifugations différentielles : Centrifugation à basse accélération Centrifugation à haute accélération sur surnageant Obtention d’un culot contenant le virus semi-purifié 2.Ultracentrifugation : séparation virus-impuretés par propriétés physiques "en gradient de densité à l’équilibre" (séparation sur base de la densité) "zonale" (séparation sur base de la vitesse de sédimentation) Obtention d’une suspension de virus très purifiée
9.4 Etude de l’acide nucléique viral Analyse de restriction et hybridation moléculaire Amplification génique (PCR) Conventionnelle PCR en temps réel Séquençage Un film sur le Southerne blot et un film sur le PCR sont disponibles.
La PCR en temps réel Si on reporte sur un graphique l’évolution de la quantité d’ADN en fonction du temps, on observe cette courbe, avec une phase exponentielle (nombre de copies qui double à chaque cycle de la PCR) suivie d’un plateau, signe de la consommation des réactifs disponibles. Avec la PCR classique, vous obtenez la visualisation du résultat à la fin de la courbe. Avec la PCR en temps réel, on voit à chaque cycle l’évolution de la quantité d’ADN grâce à un système d’émission de fluorescence expliqué dans les dias suivantes.
La PCR en temps réel Chimie des intercalants : Molécules (SYBR Green, bromure d’éthidium) ayant la propriété de s’intercaler de façon aspécifique dans les doubles brins d’ADN, conformation qui les rend fluorescentes. Excitation (UV) émission de fluorescence lecture Un appareil de PCR classique est relié à un système de caméra avec mesure de la fluorescence émise. Deux façons de travailler peuvent être utilisées : les agents intercalants (ci-dessus) ou les sondes fluorescentes (dia suivantes). Les figures vous illustrent les évènements qui se produisent à chaque étape de la PCR. En haut, lors de la dénaturation, l’agent intercalant est libre puisque les molécules d’ADN sont simples brins. Au milieu, l’étape d’hybridation des amorces à leur séquence complémentaire permet le commencement de la fixation de l’agent intercalant. Enfin,la figure du bas illustre la phase d’élongation, pendant laquelle l’agent intercalant vient se fixer sur la molécule d’ADN bicaténaire en construction. La lecture de la fluorescence est effectuée à la fin de cette étape et est donc proportionnelle à la quantité de molécules d’ADN synthétisées.
PCR en temps réel Chimie des sondes : Ex. : TaqMan Chimie des sondes : Fixation d’une sonde spécifique du fragment amplifié, lié à 2 fluorochromes, 1 émetteur (en vert) et 1 récepteur (en rouge). Sonde intègre : émission uniquement par fluo récepteur (rouge) Polymérisation action exonucléasique de la polymérase sonde lysée séparation fluo émetteur et fluo récepteur Emission par fluo émetteur (vert)
Séquençage de l’ADN Détermination précise de la séquence en nucléotides (laboratoires spécialisés) Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert) Si virus à ARN : ADN complémentaire nécessaire A partir du produit de PCR ou clonage de la séquence Application : Lors d’épidémie (ex. : intoxication alimentaire), isolement d’un virus, puis envoi au labo qui séquence une partie déterminée du génome de la souche pour permettre un typage très fin du virus.
9.5 Etude des protéines virales Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif (méthionine marquée S35). Marquage de toutes les protéines néosynthétisées. Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des protéines selon leur masse moléculaire, révélation par radioactivité ou colorants spécifiques des protéines. Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur membrane puis identification des déterminants antigéniques par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode immuno-enzymatique.
Immunoprécipitation Extraction d’une protéine d’un mélange de protéines marquées radioactives, par des anticorps spécifiques liés à des billes de sépharose, Centrifugation, Analyse par électrophorèse. Marquage radioactif Immunoprécipitation Electrophorèse
Récapitulatif : METHODES D’ETUDE 9.4 De l’acide nucléique viral 9.5 Des protéines Analyse de restriction Marquage radioactif Southern blot Immunoprécipitation PCR Electrophorèse Séquençage Western blot Bien comprendre les notions de méthodes d’ETUDE et de méthodes de DIAGNOSTIC, qui ne signifient pas la même chose. Certaines méthodes peuvent être utilisées dans les deux objectifs.
9.6 Diagnostic des infections virales Pathologie clinique observée, récolte des signes cliniques Diagnostic différentiel Confirmation de l’étiologie par : - Mise en évidence de l’agent pathogène (direct) - Mise en évidence de la réponse immunitaire (indirect)
Exemple : veau présentant un jetage nasal muqueux abondant bilatéral, une conjonctivite, il est en hyperthermie et abattu. Il faut penser, entre autres, dans le diagnostic différentiel à la rhinotrachéite infectieuse virale bovine ou IBR, dont l’agent étiologique est l’herpèsvirus bovin-1. Pour faire le diagnostic direct de ce pathogène, vous prélevez un écouvillon nasal (photo de droite) duquel les particules virales, si elles sont présentes, pourront être détectées par plusieurs méthodes (effet cytopathogène ou PCR par exemple).
Diagnostic des infections virales B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac) Elisa indirect Immunofluorescence indirecte Séroneutralisation Inhibition de l’hémagglutination A.1 Non spécifiques Détermination de l’origine virale, sans identification de l’agent étiologique Effet cytopathogène Test d’hémadsorption A. Méthodes de diagnostic direct (mise en évidence du virus, Ag) A.2 Spécifiques Mise en évidence directe d’un constituant du virus Détection du génome Détection des protéines
A.1 Méthodes de diagnostic direct non spécifique I. Effet cytopathogène en culture de cellules On qualifie ces méthodes de non spécifiques car elles ne permettent pas de un diagnostic étiologique précis mais permettent d’affirmer la présence d’un virus possédant un effet cytopathogène.
Méthodes de diagnostic direct non spécifique II. Test d’hémadsorption : Ce test se base sur une propriété particulière à certains virus d’exprimer une hémagglutinine à leur surface et donc à la surface des cellules qu’ils infectent. Si une suspension de globules rouges est ajoutée au milieu de culture du tapis cellulaire infecté, ils vont être fixés à la surface des cellules qui expriment cette hémagglutinine. Virus des oreillons virus Sendai (paramyxovirus)
A.2 Méthodes de diagnostic direct spécifique Enveloppe Tégument Capside DNA Vous pouvez voir sur cette illustration les différents constituants viraux qui peuvent être recherchés pour un diagnostic direct. Glycoprotéines
Méthodes de diagnostic direct spécifique I. Visant la détection de l’ADN viral à partir du prélèvement II. Visant la détection des protéines virales : Techniques immunoenzymatiques (ELISA) Techniques immunofluorescence Vous disposez d’un film expliquant l’ELISA.
ELISA direct Echantillon positif Echantillon négatif Réactifs - Ac spécifiques des Ag d’intérêt - Echantillon inconnu Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève toutes substances non liées) - Ac couplés à une enzyme (E) spécifique des Ag d’intérêt Lavages (enlève tous les Ac-E non liés) - Substrat de l’E POSITIF : substrat converti en produit coloré NEGATIF : pas de coloration Echantillon positif Echantillon négatif Ag présents et fixation aux Ac Ag absent Etape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme Ce type d’ELISA met en évidence la présence d’antigènes dans l’échantillon.
Immunofluorescence (direct spécifique) Même principe que pour un ELISA mais les anticoprs sont couplés à un fluorochrome qui permet la révélation de la réponse sous lumière avec filtre spécial.
* * Immunofluorescence gC gE Goat anti-IgG2a de souris couplé à la FITC Goat anti-IgG1 de souris couplé à la R-PE * * Ac anti-gC d’isotype IgG2a Ac anti-gE d’isotype IgG1 gC gE Exemple d’utilisation de la technique d’immunofluorescence : on s’est intéressé à deux glycoprotéines du BoHV1, gC et gE. Par cette méthode, en utilisant deux fluorochromes différents, on peut distinguer les cellules infectées par un virus qui expriment soit les 2 glycoprotéines, soit l’une ou l’autre glycoprotéines.
Immunofluorescence FITC emission anti-gC R-PE emission anti-gE Merge Sample 1 On voit pour l’échantillon 1 que la cellule de gauche est infectée par un virus exprimant gC uniquement, la cellule de droite gE uniquement et la cellule du haut, les deux. Sample 2
B. Méthodes de diagnostic indirect ELISA indirect Immunofluorescence indirecte Séroneutralisation Inhibition de l’hémagglutination
ELISA indirect Echantillon positif Echantillon négatif Réactifs - Ag - Echantillon inconnu Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève toutes substances non liées) - Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ac (antiglobuline) Lavages (enlève tous les Ac-E non liés) - Substrat de l’E POSITIF : substrat converti en produit coloré NEGATIF : pas de coloration Echantillon positif Echantillon négatif Ac spécifiques présents et se fixent aux Ag Ac spécifique absent ; les autres Ac sont éliminés aux lavages Etape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme Ce type d’ELISA met en évidence la présence d’anticorps dans l’échantillon.
ELISA indirect de blocage Réactifs - Ag - Echantillon inconnu Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève toutes substances non liées) - Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ag Lavages (enlève tous les Ac-E non liés) - Substrat de l’E POSITIF : pas de coloration NEGATIF : substrat converti en produit coloré Echantillon positif Echantillon négatif Ag viraux fixés ; les Ac spécifiques s’y fixent Ac spécifique absent ; les autres Ac sont éliminés aux lavages Etape 1 : Ajout de l’échantillon sur le support Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de l’enzyme Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme Ce type d’ELISA met en évidence la présence d’anticorps dans l’échantillon.
Ac spécifiques se fixent aux virus Séroneutralisation Basée sur la capacité des Ac à empêcher le virus d’infecter un tapis cellulaire. Réactifs - virus - Echantillon inconnu Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire Ajouter le mélange sérum-Ag à la culture de cellules Laisser incuber (temps de multiplication du virus) POSITIF : les Ac ont empêché la multiplication virale : le tapis cellulaire est intact NEGATIF : le virus s’est multiplié et a détruit le tapis cellulaire Echantillon positif Echantillon négatif Ac spécifiques se fixent aux virus Ac spécifique absent Etape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale Etape 3 : Lecture du résultat après coloration Etape 2 : Mise en contact du mélange avec un tapis cellulaire confluent
Séroneutralisation 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 T + T - Sérum 1 Sérum 2 Exemple de résultats d’une séroneutralisation, 4 sérums ont été testés en triple. Les deux rangées du bas sont les contrôles positifs et négatifs (ils permettent de vérifier respectivement que le virus est bien apte à lyser les cellules et que le tapis cellulaire non infecté reste bien intacte). Les sérums sont déposés en dilution successives, de deux en deux. Si nous regardons de plus près le sérum 1, nous voyons que pour observer un tapis cellulaire intact dans les trois répétitions, il faut regarder la dilution ¼. Ce sérum est donc séroneutralisant à la dilution ¼. T + T -
Inhibition de l’hémagglutination Basé sur la capacité des Ac à neutraliser le virus Pas de fixation du virus aux GR Réactifs - Virus - Echantillon inconnu Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire Ajouter une suspension de globules rouges (GR) POSITIF : les Ac ont empêché la fixation des GR aux virusinhibition de l’hémagglutination NEGATIF : le virus se fixe aux GRhémagglutination Echantillon positif Ac spécifiques se fixent aux virus Echantillon négatif Ac spécifique absent Inhibition de la fixation des virus aux GR Fixation des virus aux GR Etape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale Etape 3 : Lecture du résultat (voir photo dia suivante) Etape 2 : Mélange avec une suspension de globules rouges Ce test n’est applicable qu’aux virus exprimant une hémagglutinine à leur surface. Le résultat positif est visible par un point dû à la sédimentation des globules rouges et donc à l’inhibition de l’hémagglutination. Le résultat négatif se manifeste par un fond de puits plus diffus, résultat de l’hémagglutination. Il faut impérativement effectuer ce test dans un tube ayant un fond qui ne soit pas plat.
Récapitulatif : 9.6 METHODES DE DIAGNOSTIC B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac) Elisa indirect Immunofluorescence indirecte Séroneutralisation Inhibition de l’hémagglutination A.1 Non spécifiques Détermination de l ’origine virale, sans identification de l’agent étiologique Effet cytopathogène Test d’hémadsorption A. Méthodes de diagnostic direct (mise en évidence des virus, Ag) A.2 Spécifiques Mise en évidence directe d’un constituant du virus Détection du génome Détection des protéines