Les enzymes de restriction Biologie Moléculaire Les enzymes de restriction
Enzymes de Restriction Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes
5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Palindromes La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’
5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’
Différentes Extrémités sont Générées 3’-C C T G A A G T C C-3’ G-5’ Extrémités franches
Différentes Extrémités sont Générées 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Extrémités 5’ protubérantes
Différentes Extrémités sont Générées 3’-C 5’-G G A T C C-3’ C T A G G-5’ Extrémités 3’ protubérantes
Compatibilité des Extrémités Extrémités franches HO P OH O P Compatible
Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible
Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Appariement GATC-P O P-CTAG O Compatible
Compatibilité des Extrémités Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Appariement GATC-P OH P-TCCA HO Incompatible
Cartes de Restrictions
Cartes de restrictions Déterminer les positions des sites de restrictions Cartes d’ADN linéaires Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Cartes d’insertions dans un vecteur Cartographie des génomes Analyse Southern
Approche Déterminer si l’ADN a été digéré La digestion est elle complète ou partielle? Combien de coupures? Déterminer les positions relatives
L’ADN est-il digéré? Comparez au témoin non digéré Échelle Témoin Quelles échantillons n’ont pas été digérés? 1 et 4 Quelles échantillons ont été digérés? 2 et 3 1 2 3 4
La digestion est-elle complète? Digestion complète Toutes les molécules d’ADN sont clivées à tous les sites possibles Digestion partielle Une fraction des molécules non pas été digéré Partielle non digéré Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles
Digestion complète Digestion
Digestion partielle: partielle non digéré
Digestion partielle partielle Digestion
La digestion est-elle complète ou partielle? Échelle Témoin 1 2 3 4 Comparez au témoin Vérifiez l’intensité des bandes Vérifiez les tailles
Déterminer les positions relatives Combien de coupures? Nombre de sites ADN circulaire = nombre de bandes ADN linéaire = nombre de bandes – 1 Déterminer les positions relatives La taille des fragments représente la distance entre les sites
Cartes d’ADN linéaires Enzyme Fragments (Kb) HindIII 3 et 4 SalI 2 et 5 HindIII + SalI 2 et 3 7.0 3.0 4.0 HindIII HindIII + SalI 2.0 3.0
Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Enzyme Fragments (Kb) BamHI 2, 3 et 5 HindIII 1 et 9 BamHI + HindIII 1, 1.5, 2, 2.5 et 3 3.0 2.0 1.0 1.5 2.5 7.0 10.0 1.0 9.0 10.0
Plasmides recombinants SCM X Digéré avec X Vecteur
Plasmide recombinant + Insertion X Recombinant Vecteur + insert
Déterminer la carte de restriction d’un insert Étape 1: Déterminer le site d’insertion + Insertion X Couper avec X
Cartes d’insertions Taille totale Taille de l’insertion 7.7Kb Taille de l’insertion 7.7 – 2.7 = 5.0Kb Site d’insertion Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur XbaI Enzyme Fragments BamHI 7.7Kb EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0
Déterminer l’orientation relative Le site d’insertion delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite
Déterminer l’orientation relative X A X Orientation 2 A X A X
Cartographie relative Sites a cartographier Enzyme Fragments Coupures totales Coupures vecteur Coupures insertion BamHI 7.7Kb 1 EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb 3 2 PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0 Site d’insertion
Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb 5.0
Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0
Analyse de restriction d’ADN complexe Buts Trouver la position d’une séquence dans des gros fragments d’ADN Déterminer le nombre de copies d’un gène Trouver des séquences similaires dans d’autres organismes Analyse d’ADN non-séquencé dans un organisme inconnu
Digestion d’ADN complèxe Le nombre de fragments rend l’analyse impossible
Analyse Southern Séparer les fragments d’ADN d’après leurs tailles Dénaturer Hybridation avec une sonde simple brin qui représente la région d’intérêt La sonde permet de visualiser seulement la région d’intérêt
Southern Sonde Gel d’agarose Hybridation à la sonde