MALADIES AUTO-IMMUNES Pathologies complexes : multifactorielles Facteurs environnementaux Supposés mais non prouvés Facteurs génétiques Facteurs Immunologiques - Infiltration des lésions par des cellules immuno-compétentes - Réponse aux traitements immuno suppresseurs - Modèles animaux Ex : Diabète insulino-dépendant, polyarthrite rhumatoïde sclérose en plaques

COMPOSANTE GENETIQUE DIFFICILE A CERNER Probablement plusieurs gènes impliqués (modèles de transmission familiale) Chaque gène n’aurait pas le même poids dans la susceptibilité Les pathologies sont hétérogènes avec des histoires naturelles différentes en fonction des formes cliniques des gènes différents Le caractère multifactoriel des pathologies auto-immunes complique l’analyse gène de susceptibilité en l ’absence de composante environnementale pas d ’incidence de la maladie A ce jour : seuls les gènes du Complexe Majeur d ’Histocompatibilité clairement identifiés (le plus souvent HLA classe II) Le risque relatif associé à HLA reste faible Ex : SEP DRB1*1501 DQB1*0602 RR  3 (50 % des patients)

HLA ET AUTO-IMMUNITE 1ère description chez l’Homme : 1971 (Mac Devitt) Depuis, plus de 30 associations HLA et maladies décrites Accès à la biologie moléculaire : notion de séquences spécifiques à risque la plus documentée DQB ASP-57 nég dans le DID chez l’Homme et la souris NOD Cependant les mécanismes sous-tendant ces associations restent mal compris du fait : . de la complexité de ces maladies . de notre ignorance de l’événement déclenchant . de la méconnaissance des autres facteurs génétiques associés . de l’absence de définition de l’Ag cible

QUELS SONT LES GÈNES DU COMPLEXE HLA IMPLIQUÉS Complexe HLA 224 gènes parmi lesquels 128 fonctionnels 40 % fonction immune De nombreux gènes candidats sont en fort déséquilibre de liaison difficulté de conclure

GÈNES DU CMH ET MALADIES AUTO-IMMUNES Des associations génotypiques aux motifs de séquences : Comment le CHM sélectionne le peptide antigénique ?

ALLELES DE SUSCEPTIBILITE A LA PR : LOCUS DRB1 70 60 55 P.R. 50 Témoin 40 28 30 20 18 20 13 7.7 6 3.3 2.6 0.6 *0101/*0102 *0401 *0404 *0405 *0408 p < 0.04 p < 10 - 7 p < 0.04

LOCUS DRB1 / PR Séquences de susceptibilité DRB1 70 71 72 73 74 *0101 Q R R A A *0102 Q R R A A *0401 Q K R A A *0404 Q R R A A *0405 Q R R A A *0408 Q R R A A *1001 R R R A A

LOCUS DRB1 / PR Séquences de susceptibilité (SE) Variations de l ’aa en position 71 53.7 P.R. 27.4 50 30 Témoin 25.4 23.8 38.7 22.6 29.8 20 16 25 10 5 3.5 1.5 1.5 SE-SE SE-X K-R R-X K-K R-R OR = 8.4 OR = 1.8 OR = 20.5 OR = 2 Human Immunology - 1996

ASSOCIATION DRB1*04 ET MALADIES AUTO-IMMUNES Comment les séquences d ’ancrage déterminent différentes maladies auto-immunes et permettent de remonter aux épitopes reconnus par les LyT autoréactifs ?

CRITERES STRUCTURAUX POUR DES PEPTIDES CANDIDATS DANS DEUX MALADIES AUTO-IMMUNES ASSOCIEES A DR4 P.R.. Pemphigus Allèle DR4 impliqué DRB1*0401 / *0404 DRB1*0402 R2sidus polymorphes LQ R V (*0404) IDEV (*0402) DRB 67-70-71-86 LQ R G (*0401) Charge en position DRB71 positive négative Charge en position 4 négative (D or E) positive (K or R) Critères pour les peptides P1 : V, L, I, M, F P1 : V, L, I, M, F sélectionnés P4 : D, E P4 : K, R P6 : S, T, N, V P6 : S, T, N, V Auto-antigène Inconnu Desmogléine 3 Réponse T TH1 TH2

PEPTIDES CANDIDATS DANS LE PEMPHIGUS MOTIF 1 4 6 V K S L R T I N M V F 7 peptides dérives de la séquence de la desmogléine peuvent se fixer sélectivement sur la molécule présentatrice DRB1*0402 : 78-93 190-204 251-265 97-111 206-220 512-526 762-786 Possibilité de prédire l ’épitope T reconnu pour un auto-antigène connu

IMPORTANCE D’IDENTIFIER LA MOLECULE DE PRESENTATION Exemple de la Sclérose en plaques

Quelles stratégies pour identifier les gènes impliqués ? STRATEGIE DE CRIBLAGE ANONYME : Etude dans un large panel de familles atteintes des fréquences et de la transmission de marqueurs polymorphes (VNTR : Variable Number Tandem Repeat), répartis sur l ’ensemble du génome Objectif : repérer des régions chromosomiques à risque STRATEGIE GENES CANDIDATS : 1 - Sélectionner un gène dont le produit est potentiellement impliqué dans la physiopathologie de la maladie 2 - Déterminer l ’existence d ’un polymorphisme de ce gène (SNP : Single Nucleotide Polymorphism) - soit à partir des banques de données (séquençage du génome humain) - soit en séquençant le gène sur un panel d ’individus 3 - Tester le(s) SNP caractérisé(s) sur des familles atteintes : - analyses de transmission du polymorphisme . «Familles triplets » informatives +++ : test TDT . « Familles à cas multiples » : test IBD

PRINCIPE DES METHODES STATISTIQUES : TEST IBD 1 germain a une chance sur 4 de partager 2 H avec le patient IBD2 : 25 % 1 germain a une chance sur 2 de partager 1 H avec le patient IBD1 : 50 % 1 germain a une chance sur 4 de partager 0 H avec le patient IBD0 : 25 % En analysant 100 familles de paires de germains atteints pour un marqueur donné : attendu (si pas de liaison) observé IBD2 25 (25%) 40 (40%) distorsion par rapport à IBD1 50 (50%) 55 (55%) transmission du marqueur IBD0 25 (25%) 5 ( 5%) au hasard gène de susceptibilité

PRINCIPE DES METHODES STRATISTIQUES TDT (Transmission Disequilibrium Test) allèle 1 - Soit un marqueur biallélique SNP allèle 2 - Sélectionner parmi les familles de triplets celles où, au moins, un parent est hétérozygote pour le SNP Allèle 1 Allèle 2 - Si l’allèle n’est pas lié à la maladie, la probabilité de transmission de l’allèle 2 du patient serait de 50 % Sur 100 parents informatifs allèle1/allèle 2, le résultat attendu serait . fréquence allèle 2 transmis : 50 . fréquence allèle 2 non transmis : 50 - En cas de liaison avec la maladie, fréquence augmentée de l’allèle 2 transmis à l’enfant atteint ex 70 % allèle 2 impliqué dans la susceptibilité génétique

CONTRAINTES POUR CE TYPE D’ETUDE Prélèvements des patients et de leurs parents Disposer d’un grand nombre de familles (seuls les parents hétérozygotes sont informatifs) AVANTAGES Se libérer de l’utilisation d ’une population contrôle (biais dans l’appariement) Les familles sont leur propres contrôles

ASSOCIATION DE L’HAPLOTYPE DRB1*1501-DQB1*0602 AVEC LA S.E.P. DR OU DQ ?

ANALYSE DE FAMILLES TRIOS SEP PAR TDT - 170 familles SEP - 76 parents informatifs : DRB1*1501 - DQB1*0602 DRB1* X DQB1* X 0% 25% 50% 75% 100% n = 62 n = 14 observed expected Transmis Non transmis Liaison avec la SEP p < 10-7 (Science 1997) Chez les Caucasiens : DRB1*1501 et DQB1*0602 en déséquilibre de liaison absolu QUESTION : DR? ou DQ ?

DISTRIBUTION DES ALLELES DRB1*15 et DRQ1*0602 DANS LA POPULATION MARTINIQUAISE CONTROLES LOCAUX CONTROLES MARTINIQUAIS (n = 200) (n = 100) *1501 (88 %) * 1501 ( 13 %) DRB1*15 26 % *1502 (12 %) 21 % * 1502 (13 %) *1503 ( 0 %) * 1503 (74 %) *1501 (10 %) DQB1*0602 21 % *1501 (100 %) 29 % *1503 (48 %) *1101 (21 %) autres (21 %) CONCLUSION CHEZ LES MARTINIQUAIS *1503 sous-type de DR15 le plus fréquent 42 % des allèles DQB1*0602 non associés à DRB1*15 Tissue Antigens - 2001

ASSOCIATION DR-DQ ET SEP EN MARTINIQUE CONTROLES S.E.P. (n = 100) (n = 63) DRB1*15 21 % (n = 21) 39.7 % (n = 25) p 0.01 OR = 2.47 DRB1*1501 3 % (n = 3) 12.7 % (n = 8) p < 0.05 OR = 4.70 DRB1*1503 15 % (n = 15) 28.5 % (n = 18) p < 0.05 OR = 2.26 DQB1 *0602 29.0 % (n = 29) 49.2 % (n = 31) OR = 2.01 DQB1*0602 15.2 % (12 / 79) 15.4 % (6 / 39) NS (DR15 neg) CONCLUSION Chez les Martiniquais : DQB1*0602 rôle neutre dans la S.E.P. : DRB1*1501 et *1503 impliqués DR > DQ Tissue Antigens 2003

ETUDES FONCTIONNELLES DRB1*1501 et *1503 plus important que DQB1*0602 Dans la S.E.P., le peptide MBP 85-99 est considéré comme un peptide immuno-dominant potentiellement auto-antigénique Sa présentation est HLA-DRB1*1501-DQB1*0602 restreinte Hypothèse : si DRB1*1501 et *1503 jouent un rôle réel dans la maladie en présentant MPB 85-99, ils doivent partager les mêmes capacités de présentation pour ce peptide ETUDES FONCTIONNELLES

APPROCHE MÉTHODOLOGIQUE Une lignée T CD4 spécifique du peptide 85-99 a été générée chez un sujet DRB1*1501-*0401 La spécificité de la lignée est contrôlée par un test de prolifération : IS > 2  cpm > 500 La lignée est testée dans différents contextes de présentation DRB1*1501, DRB1*1503, DRB1*0401 La restitution HLA-DRB1 est confirmée par des tests de blocage avec un anticorps monoclonal anti-DR (L243)

ETUDES FONCTIONNELLES : ROLE DE DR Figure 1 : Expérience de blocage de la reconnaissance du peptide MBP 8589 Figure 2 : HLA de la lignée T MBP 85-89 spécifique L ’APC DRB1*1503 présente le peptide MBP 85-89 à la lignée T spécifique avec la même efficacité que l ’APC 1501 (IS = 30)

Une étude génétique chez des sujets non caucasiens suggère que DR est plus important que DQ dans la génétique HLA de la SEP Au niveau du locus DR, deux allèles proches sont impliqués : . DRB1*1501 Caucasiens . DRB1*1501 Martiniquais et *1503 Les caractéristiques structurelles de *1501 et *1503 sont en accord avec les données fonctionnelles L ’ensemble de ces résultats suggère que l’association DR / SEP rend plus vraisemblablement compte d’un rôle direct de DR dans la maladie que d ’un déséquilibre de liaison avec un autre gène non identifié CONCLUSION

IMPLICATION DES MOLECULES HLA DANS LE PROCESSUS AUTO-IMMUN Les molécules HLA contrôlent la réponse T auto-immune à deux niveaux : - en sélectionnant le répertoire T des cellules matures - en sélectionnant le répertoire de peptides présentés au lymphocytes T

LES LECONS DU MODELE ANIMAL : LES SOURIS TRANSGENIQUES Comment HLA sélectionne le répertoire T ?

ANALYSE DES SOURIS DOUBLEMENT TRANSGÉNIQUES POUR HLA ET TCR (SANTAMARIA ET AL - 1997) Souris NOD (I-Ag7) transgénique pour un TCR spécifique d’un antigène des cellules beta de Langerhans . accélération du DID . le TCR transgénique (VB11) positivement sélectionné Souris transgénique croisée avec des souris I-Ab, I-Aq, I-Ak . le nombre total de thymocytes est réduit . le nombre de T CD4 VB11 est . l ’animal est protégé du diabète CONCLUSION : le HLA protège la souris NOD via une sélection négative (valable pour ce transgène)

ANALYSE DES SOURIS DOUBLEMENT TRANSGÉNIQUES POUR HLA ET TCR (MATHIS ET AL - 1998) Souris NOD (I-Ag7) transgénique pour un TCR spécifique de l ’insuline . insulite massive à 3 semaines . diabète à 20 semaines Croisement de la souris transgénique avec une souris I-Ab . la souris I-Ag7b montre une incidence réduite de DID comparée à la souris I-Ag7 homozygote . pas d ’évidence d ’une délétion du TCR transgénique . du nombre de LyT utilisant un TCR  endogène CONCLUSION : Le HLA protège du diabète pour une sélection positive de clones T endogènes à effet protecteur

MALADIES AUTO-IMMUNES ET DIFFERENCIATION T Comment HLA sélectionne Th1 / Th2 ?

L ’AFFINITE HLA-PEPTIDE CONTRÔLE LA DIFFERENCIATION Th1/Th2 Génotype Peptide Affinité Différenciation CMH-peptide T A. SW (H-2 S) EAIQPGCIGGP K +++ Th1 APL : EAIQPGCIGGP + / - Th2 BIO.PL (H-2 u) ASQ M RPSQR +++ Th1 APL : ASQ R RPSQR + / - Th2 A.SW (H-2 S) EAIQPGCIGG P K +++ Th1 APL : EAIQPGCIGG A K + / - Th2 Une affinité élevée d ’une molécule HLA pour un peptide favorise une différenciation Th1

Pour une même densité de complexe HLA/peptide la nature de la molécule HLA contrôle la différenciation Th1/ Th2 Génotype Chargement in vitro Densité complexe Différenciation CPA du peptide CMH-peptide Th1 / Th2 H - 2 S 0.1 µM + / - Th2 10.0 µM +++ Th1 H - 2 b 10.0 µM + / - Th2 100.0 µM +++ Th2 Chez la souris H-2b, le génotype CMH contrôle la différenciation fonctionnelle Th1/Th2 en sélectionnant un répertoire T de faible affinité pour le complexe CMH-peptide

INTERACTIONS HLA / AUTRES SYSTEMES GENETIQUES Exemple de la sclérose en plaques : HLA et CTLA-4

ARGUMENTS EN FAVEUR CTLA-4 GENE CANDIDAT CTLA-4 localisé en 2q33 : région identifiée par Ebers et al (1996) comme potentiellement à risque dans la SEP Rôle de CTLA-4 dans la régulation de l’activation lymphocytaire T Le traitement par un anticorps anti-CTLA-4 de souris EAE : sévérité de la maladie +++ Chez l’homme : CTLA-4 gène potentiellement candidat dans plusieurs maladies auto-immunes (diabète, maladie de Basedow, maladie d ’Addison, thyroïdite de Ashimoto) Dans la sclérose en plaques, aucune étude concluante portant sur les polymorphismes connus - SNP A/G en position 49 de l’exon 1 - microsatellite (AT)n en position 642 de l’exon 4 - SNP C/T en position -308 du promoteur

STRATEGIE 1 - Existe-t-il d ’autres polymorphismes (SNP) encore non décrits du gène CTLA-4 qui pourraient être informatifs ? Réponse : 149 sujets contrôle sains séquencés . mise en évidence d ’un nouveau polymorphisme SNP caractérisé par une substitution C/T avec fréquence de T = 9.4 % 2 - Mise en place de conditions expérimentales simples permettant de génotyper ce nouveau SNP dans une large cohorte d ’individus . Choix PCR-SSP 3 - Génotypage de 1233 individus appartenant à 411 familles triplets SEP (banque nationale sclérose en plaques)

GENE CTLA-4 (CD152) ET SCLEROSE EN PLAQUES

RESULTATS ANALYSE TDT SUR SNP C/T DE CTLA-4 Parents informatifs Allèle C Allèle C Témoin p hétérozygotes C/T transmis non transmis % Familles SEP 126 75 51 59.8 0.03 (n = 411) Familles DR15+ 66 48 18 73.1 0.0002 (n = 215) Familles DR15- 60 27 33 45.0 NS (n = 196) La comparaison de la transmission de l’allèle C dans le sens groupes DR15+ et DR15- 2 = 10, p < 0.002 Argument : - en faveur de l ’hétérogénéïté génétique de la SEP - en faveur d ’une interaction CTLA-4 / DR15

REPLICATION DE L’ETUDE SUR UNE COHORTE INDEPENDANTE 199 Familles triplets SEP d ’Europe du Sud : Italie (n = 113), Portugal (n = 86) Parents informatifs Allèle C Allèle C Témoin p hétérozygotes C/T transmis non transmis % Familles SEP 67 46 21 68.7 0.002 (n = 199) Familles DR15+ 21 16 5 76.2 0.02 (n = 60) Familles DR15- 46 30 16 65.2 0.04 (n = 139) Résultats non contradictoires avec les données préliminaires négatives à partir des autres SNPs connus et déjà étudiés . SNP -308 négatif sur les familles testées (49 T, 46 NT) . pas de déséquilibre de liaison avec -308 (p = 0.29)

GENE CTLA-4 ET SCLEROSE EN PLAQUES