Bi 231: Ingénierie des Protéines cours 2

Plan Général I. Introduction et rappels. II. Purification des protéines. III. Surexpression d'une protéine. IV. Mutagenèse: techniques et applications. V. L'insuline : exemple d'une stratégie. VI. Analyse d'articles.

III. Surexpression d'une protéine. 31 –Cahier des charges. 32 –Expression chez E. coli - Avantages. - Organisation générale d'un vecteur - Exemples de systèmes d'expression. - Les différentes souches de E. coli existantes - Les paramètres ajustables lors d'une surexpression 33 –Autres hôtes bactériens : avantages et inconvénients. 34 –Expression chez la levure : Hôtes et vecteurs disponibles. 35 –Expression dans des cellules Eucaryotes supérieures animales et végétales.

31 Cahier des charges (1) définir le(s) but(s) de cette surexpression : tests enzymatiques => purifier la protéine tout en conservant sa fonction production d’anticorps spécifiques => très grande pureté mais fonctionnalité et structure non nécessaire injection chez homme, animal => Absence d’impureté immunogène et/ou toxique, stérilité, absence de particules en suspension, pH, ... (normes européennes)

31 Cahier des charges (2) définir l’origine et caractéristiques de la protéine surexprimée : Procaryotes, Archée, Eucaryotes primitifs, supérieurs (animal, végétal), ... => modif° post traduct°les, code génétique (fréquence des codons). Localisation cellulaire. Cofacteurs. Coexpression

En fonction de ce cahier des charges, détermination du couple vecteur-hôte Hôtes : Bactéries : - E. coli - autres (L. lactis) Levure (S. cerevisiae, S. pombe, ...) Cellules animales (insectes, mammifères). Cellules végétales et végétaux (Arabidopsis, OGM). Vecteurs : plasmides : ADNdb circulaire bactériophages (=virus des bactéries) Bacculovirus Sindbis Virus Virus de la vaccine EBV TMV

32 –Expression chez E. coli Avantages : Culture rapide et facile (x2 /20-30 minutes). Génétique bien connue : - nombreux vecteurs et souches disponibles. milieu de culture défini Inconvénients : modifications post traductionnelles => Méthode « par défaut » : la plus simple et la mieux définie

32 –Expression chez E. coli Composition d’un vecteur Promoteur Origine de réplication Site de clivage multiple (insertion du gène gène de résistance (sélection) + - Système de régulation inductible - Séquence protéique supplémentaire (purification, identification, ...) - Origine de réplication autre - gène rapporteur - ...

32 –Expression chez E. coli Exemples de vecteurs :pET pET100/D/lacZ 8836 nucleotides T7 promoter: bases 209-225 T7 promoter priming site: bases 209-228 lac operator (lacO): bases 228-252 Ribosome binding site (RBS): bases 282-288 Initiation ATG: bases 297-299 Polyhistidine (6xHis) region: bases 309-326 Xpress™ epitope: bases 366-389 EK recognition site: bases 375-389 lacZ ORF: bases 405-3476 T7 reverse priming site: bases 3538-3557 T7 transcription termination region: bases 3499-3627 bla promoter: bases 3928-4026 Ampicillin (bla) resistance gene: bases 4027-4887 pBR322 origin: bases 5032-5705 ROP ORF: bases 6073-6264 (complementary strand) lacI ORF: bases 7576-8667 (complementary strand)

32 –Expression chez E. coli Exemples de vecteurs :pBAD • Topoisomerized vector for 5-minute TOPO® Cloning of Taq-generated PCR products • Enterokinase cleavage site to remove thioredoxin after protein purification (if desired) • C-terminal V5 epitope for detection and analysis with the Anti-V5 antibodies • C-terminal 6xHis tag for rapid purification with ProBond™ resin and detection with the Anti-His(Cterm) antibodies

32 –Expression chez E. coli Exemples de vecteurs :pBAD

32 –Expression chez E. coli Systéme Gateway® Permet d'utiliser un gène placé dans un vecteur pour des utilisations et expressions très différentes. Basé la capacité de recombinaison spécifique du bactériophage l.

32 –Expression chez E. coli Exemples de vecteurs :pBAD

32 –Expression chez E. coli Souches de Escherichia coli But recherché BL21 DH5 DH10 TOP10 Amplification/Stabilité des plasmides souche a-E souche B-T1R souche F' Expression de protéines souche DE3 DH5αF´IQ™ Souches Exemple : souche BL21 DE3 : F- ompT hsdSB (rB-, mB-) gal dcm rne131 (DE3) F- : pas de gène pour pillus; ompT: déficit en une protéase ; hsdSB (rB-, mB-) déficit en une endonucléase ; ...

32 –Expression chez E. coli Paramètres ajustables : Température  si basse certaines protéines sont stabilisées mais tps de culture augmente beaucoup ... Agitation, rapport contenant/contenu  oxygénation. Nature du milieu. Types de souches (présence/absence de protéases), co expression avec autres protéines (chaperons)  stabilise ...

33 –Autres hôtes bactériens. Rare : Bactérie exprimant des protéines ne pouvant être produites chez E. coli Car - cofacteur non disponible (chaîne resp.). - surexpression homologue - analyse génomique prot memb de Lactococcus lactis (Kunji BBA 2003, 1610 97).