Outils Bioinformatiques pour l‘Analyse du Microenvironnement Tumoral Dr. J. Galon Matthieu CAMUS INSERM U255 Dirigée par : Pr. H. Fridman Centre des Cordeliers Paris VI

Cellules présentatrices d’Antigènes Background Immunologie des Tumeurs Cellule Dendritique Cellules présentatrices d’Antigènes Stroma Facteurs de croissance Lymphocytes T Régulateurs, Lymphocytes B, NK, Macrophages … Lymphocytes T Effecteurs Cytokines Chemokines Tumeur Micro-Environnement Tumoral -> analyses à Large-échelle pour l’étude des cellules infiltrantes

Colon cancer : Approaches parameters patients DNA MicroArrays (n=12000) 12000 10 CIPHERGEN Collaboration SELDI-TOF (proteomic) FACS Functional Data (n=980) FACS Phenotype Data (n=820) APPLIED Collaboration Taqman PCR LDA (n=48) ALPHELIS Collaboration Tissue MicroArrays (TMA) (1 marqueur cellulaire, deux régions) 10 950

Base de données (autorisation/authentification/CNIL) Gestion des données cliniques Gestion des données biologiques et expérimentales Modules de connections aux appareils de laboratoire Requêtes multicritères (listing, analyse) Connections aux autres bases (MARS, publiques) Connections aux logiciels d’analyse (Genesis, PathwayExporer) Modules d’analyses et statistiques

-> plus de 500 000 paramètres (+ 20 versions) Ici juste à titre d’exemple, vous pouvez voir une page patient de la base TME. Cette base à été construite par étapes successives et plus de 20 versions ont été généré. Tous les jours, des données sont entrées dans la base, et Bernhard et Robert y ajoute de nouvelles fonctionnalité, dont la dernière date du 14/12/2005. Il y a actuellement 1221 patients inclus dans TME, et cela représente plus de 500 000 paramètres inclus dans TME. 14.12.2005 By B. Mlecnik & R. Molidor V1.5.2 -> 1221 patients inclus -> plus de 500 000 paramètres

TME (autorisation/authentification/CNIL) PhAnS FAnS Databases Query Pathways Ontology Pubmed MARS Databases ClueGO Knowledge Explorer ARACNe mapper Query Pathway Software Genesis Stats (autorisation/authentification/CNIL) DATA Connection PhAnS FAnS TME Une partie des développements bioinformatiques que nous avons réalisé repose sur la constitution de bases de données, dont TME, pour Tumoral MicroEnvironnement database. Il s’agit d’une base de données sécurisées qui a eu l’agrément de la CNIL, puisqu’elle contient des données sensibles sur des patients. Dans cette base de donnée, est intégré l’ensemble des informations cliniques ainsi que tout le matériel biologique dont nous disposons. L’ensemble des expériences dont je vous ai parlé sont intégré dans TME de façon automatisé, grâce à des modules de connections (PhAnS et FAnS) que nous avons généré, qui permettent une connections des appareils de laboratoire à la base TME. Ensuite au travers de systèmes de requêtes multi-critères, nous pouvons analyser les résultats, grâce à des logiciels que nous avons développés avec les bioinformaticiens. Par ailleurs, TME est connectée à d’autres bases que nous avons construites ou à des bases publiques. v.1.5.2 14/12/2005 Clinical info Material

Exemple: Analyses FACS Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents) Acquisition (cytomètre) Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db) Analyses Statistiques (StatView, Excel) Clustering Marqueurs/Patients (Genesis)

Analyses FACS CD3 SSC (forme) (MFI) (%) CD3 CD8

PHENOTYPIC ANALYSIS PhAnS2 Flow cytometry TME

Tri et stockage des données FACS 416 paramètres

Global representation of clustered marker expression values (% and MFI) -2 +2 % 100 MFI 1 104 39 patients Genesis software 616 parameters

Représentation et analyse des données FACS Principal Componant Analysis (PCA) Healthy donnors (in vitro stimulation) Patients (A) colon cancer Patients (B) colon cancer Healthy donnors Patients (C) Non-tumoral

Analyses Bioinformatiques Vers de nouvelles approches d’analyse globale 1) Nouvelles méthodes de visualisation de groupes fonctionnels Intégration aux voies de signalisation (PathwayExplorer) Intégration aux données d’ontologie (ClueGO) 2) Analyse des réseaux d’interactions Analyse de reconstruction de réseau cellulaire (ARACNe) Analyse des interactions positive et négatives indirectes 3) Intégration automatique de la connaissance aux données Cartographie de la bibliographie (KnowledgeExplorer) (15 millions d’articles scientifiques) Analyse en réseau de prédiction

ARACNe (algorithm for the reconstruction of accurate cellular networks) Nat Genet. 2005 (4):382-90. Reverse engineering of regulatory networks in human B cells. Basso K, Margolin AA, Stolovitzky G, Klein U, Dalla-Favera R, Califano A.

Cancer Colorectal Un des cancers les plus fréquents 4ème cause de décès dans le monde (environ 500.000 décès par an) Incidence Accrue (+40% ces 20 dernières années)

Background Le rôle de l’infiltrat immunitaire dans le contrôle des étapes précoces de l’invasion métastatique (VELIPI) est peu connu chez l’homme et pourrait avoir un impact important sur le devenir clinique des patients. VELIPI : venous emboli (VE) lymphatic invasion (LI) perineural invasion (PI)

Observations Préliminaires Analyses univariées de survie sur la population de patients (n = 959): 25 75 125 175 225 Survival (months) 20 40 60 80 100 Overall Survival (%) [VELIPI ]=yes [VELIPI ]=no VELIPI est un puissant facteur pronostic (p<10-9)

Première Question Quelles sont les différences quantitatives et qualitatives de l’infiltrat immunitaire entre les patients présentant des signes précoces d’invasion métastatique (VELIPI+) par rapport aux patients VELIPI-? Analyses de coupes de tissus Analyses FACS Analyses PCR (Applied-Biosystems).

Coupes de Tissus Les patients VELIPI- presentent une fréquence accrue TUMEUR n=377 Les patients VELIPI- presentent une fréquence accrue d’infiltrat immunitaire fort par rapport aux patients VELIPI+.

FACS : Cellules Totales P<0.05 VELIPI + VELIPI - FACS : Cellules Totales * % positive cells n=39 Diminution significative de l’infiltrat lymphocytaire T chez les patients VELIPI+.

Taqman LDA Les patients VELIPI-/récidive- présentent Reponse Immunitaire Adaptadive CD8a 100 200 300 + - + - GZM-B 200 400 600 GNLY 200 400 600 800 + - IFN-g 200 400 600 + - Specific gene/18S RNA (%) n = 75 VELIPI Relapse p<0.05 Les patients VELIPI-/récidive- présentent des réponses immunitaires adaptative plus fortes

Conclusions 1 Diminution significative de l’infiltrat (lymphocytes T) chez les patients VELIPI+ par rapport aux patients VELIPI-. Corrélation entre les réponses immunitaires adaptatives conduites par les lymphocytes T CD8 effecteurs et les patients VELIPI- qui ne subiront pas de rechute.

Analyses des Tissue MicroArrays (TMA) Seconde question Les lymphocytes T effecteurs et effecteurs-mémoires sont-ils directement impliqués dans le contrôle des évènement métastatiques précoces? Analyses FACS Analyses des Tissue MicroArrays (TMA)

FACS VELIPI - VELIPI + CD45RO Mémoire p<0.05 Marqueurs d’expression significativement differencielle (p<0.05) Entre les patients VELIPI- et VELIPI+

Tissue MicroArrays (TMA) 2 zones représentative du centre de la tumeur sont forées à partir de blocs de tissus inclus en paraffine Les carottes sont déposées dons un bloc récepteur, ensuite découpé pour effectuer des analyses immunohistochimiques (IHC). CD45RO => 6640 IHC

Tissue MicroArrays (TMA) CD45RO Tissue CD45RO Analyse de spots de tissus tumoraux par Immunohistochimie (Spot Browser®, ALPHELYS)

TMA (n=415) Différences significatives de survie des patients 100 80 CD45RO-hi 60 % Survival 40 20 CD45RO-lo 40 80 120 160 Survival (months) Différences significatives de survie des patients en fonction de la densité (hi/lo) des lymphocytes T CD45RO+ mémoires infliltrés.

Conclusions 2 Cette étude à large-échelle indique un role positif des lymphocytes T effecteurs-mémoires dans le contrôle local de l’invasion métastatique et le devenir clinique des patients.

Conclusions Finales Réseau Multidisciplinaire, approches, techniques, et bioinformatique : fonctionnel et efficace Validation du concept et de sa faisabilité La nature et la densité de l’infiltrat immunitaire influencent les processus métastatiques précoces et le devenir clinique des patients atteint de cancers colorectaux. Les premières conclusions que nous pouvons porter à ce stade sont les suivantes : Tout d’abord, nous avons constitué un réseau multidisciplinaire, maîtrisé les techniques et les approches bioinformatiques. Nous avons obtenu un financement par l’INCa sur ce projet pour la période 2006-2008. Deuxièmement nous avons montré la validité et la faisabilité de ces approches par la publication dans le NEJM. Je voudrais maintenant vous présentez le projet de recherche dans d’un point scientifique que clinique, et vous montrer quelques résultats très intéressants.

Perspectives 1) Quelle est l’importance de la coordination de la réponse immunitaire sur le pronostic clinique? 2) fonctionnalité des lymphocytes infiltrant les tumeurs (activation, proliferation et migration) Donc nous avons montré dans le NEJM que la nature et la densité de la réaction immune influence le devenir clinique. Nous nous demandons donc maintenant quelle est l’importance de la coordination de la réponse sur le devenir clinique. Comme vous allez le voir nous envisageons des approches globales d’analyse et de visualisation. Le deuxième point que nous allons analyser est le suivant : « est ce que les populations immunitaires présentes dans différentes régions tumorales sont nécessaires à l ‘établissement d’une réaction immunitaire efficace ? » Pour cela nous allons analyser les populations et leur phénotype au sein de différentes régions dissequées. Nous analyserons en particulier l’orientation fonctionnelle des populations immunitaires présentes, par l’analyse de cytokines et de leurs récepteurs. Nous analyserons ensuite les capacités de migration, par l’expression des chémokines et de leurs récepteurs, aux différentes régions tumorales. Enfin, nous réaliserons des expériences, - nous avons d’ailleurs commencé les mises au point – de dissection laser de ces régions en vue de l’analyse des transcrits. Le dernier aspect ici, sera d’évaluer la fonctionnalité ex vivo de lymphocytes extraits des tumeurs, en particulier en terme de prolifération de capacité d’activation. Ici, est illustrée la très bonne capacité de réponse proliférative à un stimulus engageant le TCR sur des lymphocytes T intratumoraux de patients. Nous évaluerons la modulation possible de ces réponses au cours de l’évolution tumorale. Donc, comme je vous l’ai dis, nous avons commencé à évaluer les 2 aspects indiqué en jaune ici ; la coordination de la réponse et l’importance de régions tumorales particulières.

Merci! jerome.galon@u255.bhdc.jussieu.fr Equipe (INSERM U255, Cordeliers) Jérôme GALON, (CR) Franck PAGES, (MCU-PH) Anne COSTES, (Assistante-Ingénieur) Aurélia RODI, (Technicienne) Matthieu CAMUS, (4ième année thèse) Amos KIRILOVSKY, (1ière année thèse) Marie TOSOLINI, (1ière année thèse) Pauline BERGER, (Stage Technicienne) Nicolas GOUGELET, (Stage Technicien) Wolf-Hervé FRIDMAN (PU-PH) Bioinformatic Laboratory (Graz) Robert MOLIDOR, (PostDoc) Bernhard MLECNIK, (Thèse) Thomas RAMSAUER, (Master) Fatima SANCHEZ-CABO (PostDoc) Zlatko TRAJANOSKI (PU) Nous avons donc mis en place un petit réseau multi-disciplinaire autour de notre équipe, composé, donc de Franck, et moi, avec Anne asssistante-ingénieur, des étudiants Matthieu, Amos et Marie, et des stagiaires ESTBA. Donc comme je vous l’ai dis, l’interaction avec le laboratoire de bioinformatique de Zlatko, autour de Bernhard, Robert et Fatima. Et grâce à l’interaction entre Franck et le service de chirurgie digestive, nous avons établi une collaboration forte entre le Pr Anne Berger du service du Pr Cugnenc, et nous. Enfin, nous avons développé des partenariats industriels autour des sociétés Applied, Ciphergen pour la protéomique, Alphélis pour les TMA, et SISPIA pour l’informatique. Departement de Chirurgie Digestive (HEGP) Anne BERGER (PU-PH) Paul-Henri CUGNENC (PU-PH) Collaborations Industries Applied-Biosystems (TaqMan-LDA) Ciphergen (SELDI-TOF protéomic) Alphelys (TMA) SISPIA (Informatics) jerome.galon@u255.bhdc.jussieu.fr

jerome.galon@u255.bhdc.jussieu.fr