LES PLANTES TRANSGENIQUES: BIOREACTEURS POUR LA PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES A USAGES THERAPEUTIQUE ET BIOPHARMACEUTIQUE Dr NATO AIME Maître de Conférences Bât. 360 Institut de Génétique et Microbiologie UMR UPS/CNRS 8621 Université Paris Sud XI aime.nato@igmors.u-psud.fr 91405 ORSAY Cedex France Tél. : 01 69 15 46 93 Fax : 01 69 15 63 34

PLAN DU COURS 1) LA TRANSGENESE VEGETALE : PRINCIPES- APPLICATIONS 2) ASPECTS FONDAMENTAUX DE LA PRODUCTION DES PROTEINES HETEROLOGUES CHEZ LES PLANTES - Avantages des cellules végétales par rapport aux cellules animales et aux micro-organismes 3) AGRICULTURE MOLECULAIRE VEGETALE - Aspects génétiques de l’agriculture moléculaire chez les plantes - Modifications post-traductionnelles et purification de la protéine recombinante - Les techniques de l’agriculture moléculaire 4) EXEMPLES DE PRODUCTION DES MOLECULES BIOACTIVES PAR LES PLANTES TRANSGENIQUES 5) CONCLUSIONS - PERSPECTIVES POUR L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE PLAN DU COURS

LA TRANSGENESE VEGETALE (1/3) PRINCIPES-APPLICATIONS DOMAINE DE BIOTECHNOLOGIES CHANGEMENTS TECHNOLOGIQUES LIES A L’INGENIERIE GENETIQUE NOMBREUX DOMAINES D’APPLICATION : AGRICULTURE AGROALIMENTAIRE INDUSTRIES ENVIRONNEMENT SANTE-PHARMACIE

LA TRANSGENESE VEGETALE (2/3) LE CODE GENETIQUE EST UNIVERSEL PAS DE DIFFERENCES FONDAMENTALES ENTRE LA NATURE DES GENES D’ESPECES ANIMALES OU VEGETALES. UN GENE D’UNE ESPECE INTRODUIT DANS LE GENOME D’UNE AUTRE ESPECE CODERA POUR LA MEME PROTEINE QUE L’ESPECE DONT IL PROVIENT. L’INTRODUCTION D’UN GENE D’INTERET SE FAIT DANS UNE PLANTE, ON PARLE DE TRANSGENESE VEGETALE ET DES OGM.

LA TRANSGENESE VEGETALE (3/3) L’INTEGRATION DANS LE GENOME EST ALEATOIRE ET LA SEGREGATION EST DE TYPE MENDELIENNE. LA TRANSFORMATION EST ENVISAGEABLE LORSQUE LA REGENERATION IN VITRO EST POSSIBLE A PARTIR DES CELLULES OU DES TISSUS. APRES LA REGENERATION DES PLANTES,LA SELECTION DES TRANSGENIQUES SE FAIT GRACE A LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES , HERBICIDES… L’EXPRESSION DU GENE D’INTERETSE FAIT PAR LA VERIFICATION DE LA PRODUCTION DE LA MOLECULE RECOMBINANTE .

TRANSFORMATION DES PLANTES METHODOLOGIE INTRODUCTION DE L’ADN DANS LE NOYAU DE LA CELLULE VEGETALE PAR: BOMBARDEMENT DE PARTICULES D’ADN OU BIOLISTIQUE, APPLICABLE A TOUS LES TISSUS OU TYPES CELLULAIRES ELECTROPORATION : APPLICABLE AUX PROTOPLASTES TRANSFERT NATUREL PAR AGROBACTERIUM: ESSENTIELLEMENTAPPLICABLE AUX PLANTES DICOTYLEDONES

Le remplacement de l’ADN-T par un gène d’intérêt

Schéma du ADN-T ayant reçu le gène correspondant aux scFv des Interleukines RB = Extrémité droite R* = Gène selectif de résistan P = Promoteur scFv = Gène d’intérêt c-myc tag = Gène rapporteur T = Terminateur LB = Extrémité gauche

PRINCIPALES ETAPES DE LA TRANSGENESE VEGETALE

LES GRANDES ETAPES DU DEVELOPPEMENT DES PLANTES TRANSGENIQUES 1973 : Identification du plasmide Ti dans la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Ce plasmide permet d’accueillir le gène porteur du caractère recherché, qu’il est en mesure d’introduire dans le génome d’une plante. 1983 : Première plante transgénique obtenue (tabac au stade expérimental). 1985 : Première plante transgénique résistante à un insecte. 1987 : Première plante transgénique tolérante à un herbicide total. 1988 : Première céréale transgénique (maïs résistant à la kanamycine).

LES GRANDES ETAPES DU DEVELOPPEMENT DES PLANTES TRANSGENIQUES 1990 : Première commercialisation d’une plante transgénique : tabac résistant à un virus (Chine). 1994 : Premier légume transgénique commercialisé (tomate à maturation retardée). 1997 : Premier tabac producteur d’hémoglobine. En France : première autorisation de la culture transgénique du maïs résistant à la pyrale. 1999 : 40 millions d’ha de plantes transgéniques dans le monde. 2000 : Séquençage du génome d’Arabidopsis thaliana. 2002 : 58,7 millions d’ha de plantes transgéniques cultivées dans le monde.

APPLICATIONS DE LA TRANSGENESE VEGETALE (1/3) AGRONOMIE Résistance aux herbicides, aux insectes et contre certains virus et bactéries. Résistance aux stress ( chaleur, froid, sécheresse et salinité). Introduction des caractères pour obtenir des avantages nutritionnels, gustatifs et pour améliorer la transformation industrielle.

APPLICATIONS DE LA TRANSGENESE VEGETALE (2/3) INDUSTRIE Améliorations des procédés industriels et la qualité des produits : Exemple: diminution du taux de lignine dans les variétés de peupliers pour faciliter le blanchiment de la pâte à papier. Du colza génétiquement modifié capable de produire des copolymères biodégradables (plastique).

APPLICATIONS DE LA TRANSGENESE VEGETALE (3/3) SANTE Le secteur de la Santé humaine constitue à lui seul près de 70% du marché des biotechnologies. Molecular Farming a pour but la production de molécules nouvelles à visée thérapeutique. Recherches poussées pour la production des vaccins, des anticorps, des protéines, l’hémoglobine... … secteur industriel en pleine effervescence.

AVANTAGES DES CELLULES VÉGÉTALES La plante en tant que bioréacteur représente une alternative intéressante comparée aux microorganismes ou aux cellules des mammifères. Les protéines humaines subissent des modifications post traductionnelles pour acquérir une activité biologique. Ces modifications (glycosylation, carboxylation, lipidation) sont difficiles, voire impossible chez les bactéries ou les levures. L’approche bioréacteur végétal écarte le risque de contaminations virales, subvirales, bactériennes d’origine animale, potentiellement infectieuse pour l’homme.

AVANTAGES DES CELLULES VÉGÉTALES En effet, les virus pathogènes de l’homme ne se développent pas dans les cellules végétales. Avec les plantes transgéniques, il n’y a pas de problèmes de contamination par des endotoxines bactériennes. Les plantes se distinguent du monde animal par : Absence de réponse immunitaire Absence de réponse aux stress divers par synthèse de différentes molécules Expression de la Totipotence de la cellule végétale : régénération d’une plante à partir de n’importe quel tissu ou cellule.

TOTIPOTENCE DE LA CELLULE VEGETALE

EXEMPLES DE PLANTES TRANSGENIQUES (TABAC) REGENEREES ET CULTIVEES IN VITRO

LES AVANTAGES DES PLANTES TRANSGENIQUES COMME BIOREACTEURS (1/3) Une grande flexibilité dans la taille de production. Le coût d’implantation est faible et les modalités de culture sont simples. L’obtention des animaux transgéniques (vaches, moutons, chèvres, cochons, lapins) et les conditions de leur élevage sont chères et strictes. Les milieux de culture de cellules de mammifères et des insectes sont chers et les conditions de cultures sont strictes. Le sérum de veau fœtal et les dérivés de sérum augmentent le risque de contamination par des agents infectieux.

LES AVANTAGES DES PLANTES TRANSGENIQUES COMME BIOREACTEURS (2/3) Les protéines thérapeutiques sont dans leur grande majorité des glycoprotéines. Les modifications post-traductionnelles , en particulier la glycosylation est indispensable pour l’activité biologique et la stabilité de la molécule produite. La production par les plantes de protéines thérapeutiques correctement glycosylées et non immunogènes paraît possible.

LES AVANTAGES DES PLANTES TRANSGENIQUES COMME BIOREACTEURS (3/3) Le stockage stable des protéines recombinées dans des endroits stratégiques de la plante est possible (tubercules, feuilles, graines, fruits…). L’expression dans ces organes de stockage facilite l’extraction et la purification. Si la protéine recombinée est administrée oralement, la consommation directe de la plante est possible, réduisant le coût de l’extraction et de la purification.

EXEMPLES DE MOLECULES OBTENUES Hormone de Croissance (Somatotropine) : 1ere protéine humaine exprimée dans les plantes en 1986.Exprimée dans les chloroplastes, cette hormone peut représenter jusqu’à 7% des protéines totales. Interféron : protéine pharmaceutique humaine produite dans le riz en 1994. Collagène : protéine constitutive humaine sous forme de complexe ou polymère produite par du tabac transgénique (2000 et 2002). Phosphatase alcaline humaine, anti-trypsine humaine produite par des racines et des cellules végétales (1999).

EXEMPLES DE MOLECULES OBTENUES Hémoglobine: molécule végétale possède la même structure que la nôtre mais ne peut jouer son rôle de transporteur oxygène. Lactoferrine Humaine: protéine multifonctionnelle du lait à activités anti-bactérienne, anti-fongique,et anti-virale. Elle induit la maturation des lymphocytes, détient une activité immunostimulante, inhibe la croissance des cellules animales et l’agrégation des plaquettes, se lie à des récepteurs… Meristem Therapeutics a effectué des essais en champs de tabac transgéniques renfermant cette molécule recombinante. Les procédés d’extraction et de purification sont au point et en attente de l’autorisation de mise sur le marché…

EXEMPLES DE MOLECULES OBTENUES Albumine humaine: sous produit de la purification de molécules plasmatiques. Les besoins mondiaux sont de l’ordre de 300 tonnes par an. Une estimation la moins optimiste envisage un coût de production par les plantes cinq fois moins élevé que l’albumine purifié à partir du plasma. La protéine native entière a été exprimée dans les plantes dès 1990 et une forte accumulation (11% des protéines) par transformation chloroplastique a été observée (2003).

EXEMPLES DE MOLECULES OBTENUES Lipase Gastrique Acide: Utile au traitement oral de la mucoviscidose. Des travaux font référence à la production de l’enzyme dans les feuilles de tabac et les graines de colza. Ainsi, 1 ha de plantes transgénique permettrait la production d’un kilo d’enzyme pure. Hirudine Puissant Inhibiteur de la thrombine utilisé comme anticoagulant, dont la source naturelle est la sangsue (les glandes salivaires). On a réussi à produire dans les graines de colza transgénique de l’hirudine recombinée, biologiquement active. Deux étapes de purification permettent d’obtenir de l’anticoagulant et 600 ha de culture de colza transformé permettraient de couvrir le besoin mondial en hirudine.

EXEMPLES DE MOLECULES OBTENUES VACCINS Hépatite B: l’ingestion par les souris de pomme de terre exprimant un antigène de surface du virus de l’hépatite B déclenche une réponse immunitaire. Deux candidats aux vaccins recombinants dits « comestibles » sont actuellement en cours d’étude clinique. Il s’agit de l’antigène, dirigé contre la sous-unité B d’Escherichia Coli entérotoxinogène et celui dirigé contre la protéine de capside du virus de Norwalk. Choléra: production de la sous unité de la toxine dans la pomme de terre. Rage : glycoprotéine du virus produit par la tomate, premier exemple d’un vaccin comestible.

EXEMPLES DE MOLECULES OBTENUES LES ANTICORPS

DES ANTICORPS RECOMBINANTS (PLANTIBODIES) Un anticorps chimérique IgG-IgA sécrétoire contre l’antigène de surface de Streptococcus mutants (agent des caries dentaires) produit par le tabac (1998). Un anticorps (IgG) contre le virus de l’Hèrpes, produit par le soja (1998). Un anticorps (scFv) contre la glycoprotéine de surface de cellules carcinoembryonnaires (CEA), a été produit par le riz, la tomate, le tabac et le blé (2000). Ces anticorps sont utilisés pour l’imagerie médicale et pour les traitements thérapeutiques des cas de cancer. Des scFv sont produits par le tabac (1999) pour les traitements des lymphomes, et des IgG pour les traitements du cancer du côlon.

ASPECTS COMMERCIAUX ET TECHNIQUES DES PLANTIBODIES Il n’y a pas encore d’exploitation commerciale des anticorps produits par les plantes. Planet Biotechnology (USA) estime le coût de production d’un gramme de IgG par les plantes 10 à 20 fois moins cher au coût classique avec les cellules animales. Ce sont les étapes de purification qui alourdissent les coûts chez les plantes. Aussi, l’accumulation de ces molécules thérapeutiques dans les grains de riz ou de blé est préconisée. Il en est de même pour les «vaccins comestibles» produits par les plantes à partir des protéines immunogènes des pathogènes. Les tests sont pratiqués sur des animaux de laboratoire. Ces vaccins oraux doivent être délivrés sous forme bioencapsulée (liposomes) afin de protéger la molécule active.

ASPECTS COMMERCIAUX ET TECHNIQUES DES PLANTIBODIES Un autre aspect concerne le niveau de production de la molécule biopharmaceutique qui doit représenter au moins 1% du stock protéique. Certaines propriétés des IgG dépendent de la N-glycosylation. Les structures des N-Glycannes des plantibodies sont diverses : 40% étant de type Mannose, les 60% des oligosaccharides ont du Xylose et du Fucose liés au core Mannose. Cette structure est spécifique des plantes et ne se trouve pas chez les mammifères.

ASPECTS COMMERCIAUX ET TECHNIQUES DES PLANTIBODIES De plus, on ne rencontre pas d’acide sialique chez les plantibodies alors qu’il représente jusqu’à 10% des sucres chez un anticorps de souris. Ces différences de structure dans les glycannes n’affectent pas l’activité biologique des plantibodies. Le risque réside seulement dans des problèmes d’allergie provoqué lors traitements thérapeutiques humains. Un autre problème concerne la stabilité des molécules hétérologues bioactives et leur assemblage en structures complexes dans des compartiments de la cellule végétale (membranes, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, chloroplastes…).

TRANSFORMATION CHLOROPLASTIQUE Une approche alternative pour l’expression des protéines hétérologues consiste à intégrer le gène d’intérêt dans le génome chloroplastique. Ainsi par exemple, chez le tabac, on a réussi à obtenir 10000 copies du gène par cellule et une accumulation de la molécule recombinante de l’ordre de 47% du stock protéique.

TRANSFORMATION CHLOROPLASTIQUE De plus, on n’observe pas les effets de «gène silencieux» lors de l’intégration dans le génome du chloroplaste. La maturation de la protéine avec des ponts disulfure est correcte. La présence des molécules chaperones facilite l’assemblage et le repliement des protéines recombinantes. Ainsi, en 2000, on a obtenu la surproduction (7% des protéines totales) de l’hormone de croissance (somatotropine) dans les chloroplastes de tabac.

CONCLUSIONS & PERSPECTIVES POUR L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE OGM : Réservoirs de graines de médicaments! Non, toutes les plantes transgéniques ne sont pas à arracher! Elles apportent de réels espoirs dans le traitement de certaines maladies. La maîtrise croissante des techniques de transfert de gènes met en évidence le fabuleux potentiel du système végétal pour la production de médicaments.

CONCLUSIONS & PERSPECTIVES POUR L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE Pour l’année 2001, le ministère de l’Agriculture Française a accordé 6 autorisations de culture en plein champs à la Société Meristem Therapeutics pour produire des OGM destinés à des applications thérapeutiques : Tabac pour le collagène, maïs pour la lipase, pour l’albumine et pour la lactoferrine, du tabac pour l’interféron, un panel d’anticorps pour des traitements anticancéreux….

CONCLUSIONS & PERSPECTIVES POUR L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE Le coût pour une production à grande échelle est estimé par la Société Meristem Therapeutics à 100 fois inférieur! Autre avantage majeur de ces nouvelles substances: elles apportent une sécurité sanitaire accrue. Les plantes sont dépourvues d’effets pathogènes, en particulier de virus dangereux pour l’homme. Ces innovations sont à la base de l’Agriculture Moléculaire ou de l’Agro-Biotechnologie, important pôle économique en émergence! Demain, des pommes de terre et des bananes seront modifiées pour inoculer en douceur des vaccins…

PERSPECTIVES Obtention de racines isolées Milieu C gélosé Milieu C liquide

PERSPECTIVES

PERSPECTIVES Mode de préparation d’un vaccin comestible

BIBLIOGRAPHIE (1/2) J Wierzbicki, Des OGM aux planticorps. Biofutur (2004) 242 : 24-28 R Fischer, E Stoger, S Schillberg , P Christou, RM Twyman, Plant-based production of biopharmaceuticals .Current Opinion in Plant Biology (2004) 7 : 152-158 JK Ma, PM Drake, P Christou, The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nat Rev Genet (2003) 4:794-805. R Fischer, RM Twyman, S Schillberg, Production of antibodies in plants and their use for global health. Vaccine (2003) 21: 820-825. RM Twyman, E Stoger, S Schillberg, P Christou, R Fischer, Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology (2003): 570-578 P Ehsani, A Meunier, F Nato, A Jafari, A Nato, P Lafaye, Expression of anti human IL-4 and IL-6 scFvs in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol (2003) 52: 17-29

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COMPAGNIES OU PLATEFORMES DE BIOTECHNOLOGIES IMPLIQUES DANS LES DOMAINES DE PRODUCTIONS BIOPHARMACEUTIQUES Planet Biotechnology Inc. http://www.planetbiotechnology.com Meristem Therapeutics http://www.meristem-therapeutics.com Medicago Inc. http://www.medicago.com Prodigene Inc. http://www.prodigene.com SemBioSys Genetics Inc. http://www.sembiosys.com UniCrop http://www.unicrop.fi Biolex Inc. http://www.biolex.com Greenovation Inc. http://www.greenovation.com Chlorogen http://www.chlorogen.com Phytomedics Inc. http://www.phytomedics.com

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