Compétences Techniques Biologie Moléculaire Compétences Techniques

Compétences Micropipetage Préparation de solutions Travailler avec les concentrations Dilutions Quantités Électrophorèse sur gel d’agarose

Micropipetage- Mesurer de petits volumes Permet la mesure de microlitres (µL) 1 000 X moins que 1 millilitre 2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µL Max. 0.02 mL 0.2mL 1mL

Réglage du volume- P20 Dizaines (0, 1=10 or 2=20) Unités (0-9) Décimale (1-9 = 0.1-0.9)

Réglage du volume- P200 Centaines (0, 1=100 ou 2=200) Dizaines (0, 1-9=10-90) Unités (1-9)

Réglage du volume - P1000 Milliers (0, 1=1000) Centaines (0, 1-9=100-900) Dizaines (0, 1-9=10 - 90)

Utilisation du micropipetteur Étape 1 Insérer embout Étape 3 Insérer embout dans la solution a être prise Étape 4 Aspirer l’échantillon en relâchant lentement le piston Étape 2 Peser piston jusqu’au Premier arrêt Étape 5 Retirer pipetteur

Livraison Commencer à livrer 1er arrêt =livrer 2e arrêt = expulsion

Directives pour reproductibilité optimale Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON PROFONDEUR D’IMMERSION consistante 3-4mm sous la surface EVITER les bulles d’airs Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur

Préparation des Solutions

Définitions Solution Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique Solution composée de deux composantes Soluté Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la plus petite quantité Solvant (OU Diluent) Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout – Habituellement le plus grand volume

Concentrations Concentration = Quantité de soluté Quantité de solution (Pas solvant) Façons d’exprimer les concentrations: Concentration Molaire (Molarité) Pourcentages Masse par volume Rapports

Molarité No de Moles de soluté/Litre de solution Masse de soluté/PM de soluté = Moles de soluté Moles de soluté/vol en L de solution = Molarité

Pourcentages Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que : V/V – volume de soluté/100 mL de solution M/M – Masse de soluté/ 100g de solution M/V – Masse de soluté/100 mL de solution Tous représentent des fractions de 100

Pourcentages (suite) %V/V %M/V % M/M Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5% Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas! %M/V Ex. 16g soluté/50mL solution =32% Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas! % M/M Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9% Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!

Réduire une Concentration Une Fraction Les Dilutions Réduire une Concentration Une Fraction

Dilutions Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes Exemple : Faire du jus d’orange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus d’orange congelé avec trois (3) cannettes d’eau

Dilutions (suite) Les dilutions sont exprimées comme le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilution Dans l’exemple du jus d’orange, la dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous diriez pour l’exemple du jus : « un dans quatre ».

Dilutions (suite) Un autre exemple : Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).

Dilutions (suite) Un autre exemple : Une (1) partie d’acide concentré est diluée avec 100 parties d’eau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d’acide + 100 parties d’eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite “un dans cent un ”.

Dilutions (suite) Remarquez que les dilutions n’ont pas d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre Exemple : 1/10 ou « un dans dix»

Dilutions (suite) Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus d’une partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.

Dilutions (suite) Exemple: Deux (2) parties d’un colorant sont diluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la substance originale doit être exprimée comme étant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose : __2 parties de colorant = ___1.0___ Volume total de 10 parties x 2 x = 10 x = 5 La dilution est exprimée comme étant 1/5.

Dilutions (suite) La dilution n’est pas toujours représentée par des nombres entiers. Exemple: Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) parties de saline. Le volume total de solution est sept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore une fois, ceci est calculé en utilisant une équation de rapports et de proportions. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose: __2 parties de sang_____ = ___1.0___ Volume total de 7 parties x 2 x = 7 x = 3.5 La dilution est exprimée comme 1/3.5

Qu’est que cela veut dire?? Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de l’échantillon ajouté à 9 parties de diluant. Si cette solution était préparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvant doivent être utilisés? Ceci représente 1 partie d’échantillon ajoutée à 9 parties de diluant. En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties?

Déterminer la dilution requise Dilution: Une fraction du facteur de dilution Facteur de dilution = Conc. que j’ai Conc. que je veux Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et désirez une solution de 5mg/mL Facteur de dilution = 25mg/mL 5mg/mL = 5X Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales

Exemple Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL d’une solution de 2mM à partir d’un solution mère de 0.1M

Quantités Les quantité ne sont PAS des concentrations! Ex 1. Ex 2. Deux pommes par sac = une concentration Deux pommes = une quantité Ex 2. 10g par 100 mL = une concentration 10g = une quantité

D’une concentration aux quantités La concentration indique la quantité dans un volume donné Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimole?

Les rapports Façon d’exprimer les solutions en indiquant le rapport entre les différentes composantes: Rapports masses Rapports molaires Rapports volumes

Les rapports masses Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml d’eau Convertir les unités pour qu’elles soit les mêmes 12g de NaCl dans 100g d’eau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 12g/12g : 100g/12g Le rapport NaCl : eau = 1:8,3

Les rapports molaires Ex. 12g de NaCl est dissout dans 100ml d’eau Convertir les unités en moles 12g/(58g/mole) de NaCl dans 100g/(18g/mole) d’eau 0,2 mole de NaCl : 5,6 moles d’eau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 0,2mole/0,2mole : 5,6moles/0,2moles Le rapport NaCl : eau = 1:28

Les rapports volumes Ex. 12ml d’alcool sont ajoutés à 1L d’eau Convertir les unités pour qu’elles soit les mêmes 12ml d’alcool dans 1000ml d’eau Diviser les quantités par la valeur de la plus petite quantité 12ml/12ml : 1000ml/12ml Le rapport Alcool : eau = 1:83,3

Électrophorèse sur gel d’agarose Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après leur taille et leur conformation Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb

Plasmide non digéré sur gel - Plasmide non digéré sur gel - Les plasmide non digérés génèrent un patron de bandes La migration est une fonction de la taille et de la conformation Super enroulé Relâché Multimèrs? multimèrs relâché Super enroulé +

Migration d’ADN linéaire (plasmide digéré) La vitesse de migration est une fonction de la taille Les plus petits fragments migrent plus rapidement La vitesse de la migration est inversement proportionnelle au log10 de la taille

Migration d’ADN linéaire (plasmide digéré) - 1000 bp 850 bp 750 bp 600 bp 200 bp 100 bp +

Déterminer les tailles Taille (pb) Distance (mm) 23,000 11.0 9,400 13.0 6,500 15.0 4,400 18.0 2,300 23.0 2,000 24.0

Visualisation: Bromure d’éthidium Colorant utilisé pour rendre les acides nucléiques visibles Fluorescent sous les UV Liaison proportionnelle à La taille La quantité La conformation

Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose? Est-ce qu’il y a de l’ADN Combiens de conformations Combien de fragments Taille des fragments Taille totale des molécules d’acides nucléiques Nombre de coupures Linéaire? Circulaire?