SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR La version 2 dure ~ 30 minutes. Il faut donc couper pour arriver à 20 minutes. Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré Département de Chimie-Biologie, Université du Québec à Trois-Rivières.

Plan de la présentation Maladie de Parkinson Hypothèse de travail Brassinostéroïdes (BRs) Synthèse Résultats in vitro neuroprotection

Maladie de Parkinson 25 000 personnes atteintes au Québec (130 000 au Canada) Mort des neurones dopaminergiques (produisant la dopamine, un neurotransmetteur) dans la substantia nigra Cause = neuropathologie W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.

Maladie de Parkinson Aucun traitement curatif disponible Seulement traitement des symptômes (L-DOPA) mais après quelques années de traitement → dyskinésie De + en + indices semblent démontrer que le stress oxydant jouerait un rôle dans la mort des cellules nerveuses Dyskinésie : mouvements anormaux incontrõlés. Dopa Décarboxylase Dopamine L-dopa L.M. Sayre et al., Curr. Med. Chem., 2001 , 8, 721. H. Ehsan et al ,Plant J., 2005, 43(2), 251.

BRs et effet neuroprotecteur ?? BRs et neuroprotection = nil Étude sur la gourgane (H. Apaydin, S. Eratn, S. Ozekmekci, Movement Disorders, 15 (1), 2000) On fait manger de la gourgane (250g, 2 X / jour) à des patients atteints du Parkinson, car gourgane riche en L-dopa. Mais la [L-dopa] n’explique pas l’effet ultrabénéfique chez les patients. BRs présents dans la gourgane ! Gourgane

Effet neuroprotecteur ?? M. Nunez, P. Mazzafera, L.M. Mazorra, W.J. Siquiera, M.A.T. Zullo, Biologia Plantarum 47(1), 67-70 (2003/4) ; L.M. Mazorra, M. Nunez, M. Hechavarria, F.Coll, M.J. Sanchez-Blanco, Biologia Plantarum 45(4), 593-6(2002). Étude de l’effet de BRs sur les enzymes antioxydantes de riz et de tomates.

Effet neuroprotecteur ?? Hypothèse de travail : Comme les BRs sont connus pour activer les enzymes anti-oxydantes de certaines plantes, Que l’effet neuroprotecteur chez la gourgane (contient BRs) n’est pas seulement dû à la L-DOPA Il est possible que les BRs aient un effet neuroprotecteur sur le système nerveux.

Brassinostéroïdes phytostérols dans les plantes comestibles du Qc (betterave, carotte, maïs, radis, …) Découverts en 1979 (brassinolide) ; extrait de Brassica napus L. (colza) (4 mg à partir de 40 kg de pollen) phytohormones (croissance) si on traite les plantes avec BRs, leur développement augmente [BRs] dans les plantes : 10-6 à 10-11 %. BRs non toxique sur les mammifères (>5g/kg pour voir un effet sur souris ; Kutzmtiskii et al. , Technical Report, 1991, Institute of Bioorganic Chem., Minsk (Belarus)) Colza A. Bajguz & A. Tretyn ,Phytochem., 2003, 62(7) ,1027.

Brassinostéroïdes 24 2 3 70 BRs caractérisés et isolés

Brassinostéroïdes synthèse totale ; non produit de départ : stigmastérol 13C* (11 contigus)

Synthèses MsCl , Et3N . Toluène 0°C, 1h , atm de N2 97% Stigmastérol KHCO3 Acétone/Eau 3:1 reflux 4h 77% OTs aussi ; mais hydrolyse (isostérol) moins bonne 72% Jones 8N-CrO3 Acétone 0°C, 10 min T.C.,McMorris et al, J. Chem. Soc.Perkin Trans. 1, 1996, 295 ; K. Mori et al.,Agric. Biol. Chem.,1987, 51(7),1909.

Synthèses ~ 1:1 68% OsO4, K3Fe(CN)6, K2CO3, py-HCl LiBr DMA Reflux 4,5h OsO4, K3Fe(CN)6, K2CO3, Hydroquinidine 4-chlorobenzoate MeSO2NH2, 36j Rdt = 41% ~ 1:1 K.B. Sharpless et al, J. Am.Chem.Soc.,1988,1968.

Synthèses 68% 60% 92:8 en faveur du produit désiré py-HCl OsO4 LiBr DMA Reflux 4,5h OsO4 NMO Acétone/Eau 9:1 12h, tp 92:8 en faveur du produit désiré

Synthèses Dihydroxylation (OsO4) 70% 89% i) AcOH , H2SO4, H2O, reflux , 1h30 KOH 5% dans MeOH, Tp, 1h30 ii) DMAP, Ac2O, Pyridine, tp, 3h, Dihydroxylation (OsO4) 3-acétyl-28-Homotéastérone

Synthèses 28-Épihomotéastérone Dihydroxylation (OsO4) 65% (2 étapes) NaOH, MeOH, tp , 1h , p-NO2C6H4COOH, DEAD, P(Ph)3, THF, 0°C 15 min puis → tp 10h Dihydroxylation (OsO4) 28-Épihomotéastérone

Synthèses 95% H2 , 1 atm, Pd/C 10%, EtOAc, 24 h

BRs commerciaux 24-épibrassinolide 22S, 23S-28-Homobrassinolide naturel (pureté 96%!) non naturel (pureté >99%)

Neuroprotection Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF Différenciation cellules pendant 4 jours (dans 96 puits). Pré-traitement 3 heures avec BS Traitement 24 heures avec MPP+ + BS Prélever surnageant (qui contient LDH relâché par cellules endommagées) pour test mortalité cellulaire LDH. Dans nouvelle plaque 96 puits (sans cellules), surnageant + réactif LDH, incubation 20 minutes, lecture 490 nm, beaucoup rouge = beaucoup mortalité. PC = phéochromocytome de rat, tumeur des glandes surrénales PC12, au départ catécholaminergiques ; ajout de NGF, deviennent dopaminergiques Cellules PC12 différenciées (après traitement au NGF) Cellules PC12 non-différenciées L.A.Greene, A.S. Tischler, PNAS, 1976, 73(7), 2424.

Neuroprotection MPP+ W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889. Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF La neurodégénérescence cellulaire du Parkinson reproduite avec MPP+ MPP+ 1-Méthyl-4-PhénylPyridinium Différenciation cellules pendant 4 jours (dans 96 puits). Pré-traitement 3 heures avec BS Traitement 24 heures avec MPP+ + BS Prélever surnageant (qui contient LDH relâché par cellules endommagées) pour test mortalité cellulaire LDH. Dans nouvelle plaque 96 puits (sans cellules), surnageant + réactif LDH, incubation 20 minutes, lecture 490 nm, beaucoup rouge = beaucoup mortalité. Une fois dans le neurone, MPP+ (via différents mécanismes) augmente la production de ROS (reactive oxygen species) et diminue la synthèse de l’ATP, donc perte de neurones dopaminergiques W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.

Neuroprotection Cellules traitées avec MPP+ et nos molécules préparées Mortalité cellulaire évaluée par dosage de la LDH libérée par les cellules abîmées Différenciation cellules pendant 4 jours (dans 96 puits). Pré-traitement 3 heures avec BS Traitement 24 heures avec MPP+ + BS Prélever surnageant (qui contient LDH relâché par cellules endommagées) pour test mortalité cellulaire LDH. Dans nouvelle plaque 96 puits (sans cellules), surnageant + réactif LDH, incubation 20 minutes, lecture 490 nm, beaucoup rouge = beaucoup mortalité. LDH = lactate déhydrogénase Dosage de la LDH par colorimétrie C. Korzeniewski, D.M. Callewaert, J. Immunological Methods, 1983, 64, 313.

Neuroprotection Épibrassinolide 22S, 23S-Homobrassinolide ANOVA, Student-Newman-Keuls ***p<0,001 vs Ctrl; ooop<0,001 vs MPP+ (n=3).

Neuroprotection homocastastérone MB 57B

Neuroprotection 22,23-Dédihydroxy-28-homotéastérones

Neuroprotection MB 158 ( C=C absent)

Conclusion Synthèse de 5 BRs ou précurseurs   Synthèse de 5 BRs ou précurseurs Molécules préparées (en particulier homocastatérone) → effet neuroprotecteur Les groupements OH en 22 et 23 ne contribue à l’activité neuroprotecteur que lorsque qu’ils sont en b. Stéréochimie du 3-OH des précurseurs de la 28-homotéastérone n’influence pas l’effet de neuroprotection de manière significative Le précurseur sans C=C en 22-23 ne présente pas l’effet de protection recherché à faible concentration (10-9M). Une alimentation riche en betteraves, carottes, … pourrait aider à prévenir le Parkinson dû à la présence de BRs ? On ne peut pas le dire encore !  

Travaux futurs Poursuivre l’étude RSA (et aussi dihydroxylation !)   Poursuivre l’étude RSA (et aussi dihydroxylation !) Autres tests bio Effet antioxydant des BRs : SOD, catalase, glutathion peroxidase, dihydrorhodamine Effet anti-apoptotique des BRs : Tunel, Caspase 3, Bax/Bcl2, fragmentation ADN (elisa) Métabolisme des BRs Effet antioxidant: activité et expression SOD, activité et expression catalase (H2O2), activité Glutathion peroxidase (H2O2), dihydrorhodamine (détection ROS particulièrement peroxynitrite), Anti-apoptotique: tunel, caspase 3 activée, bax (pro-ap)/bcl-2 (anti-ap), fragmentation ADN par elisa

Travaux futurs BRs de structure “ergostane” Nouvelle méthodologie BRs   BRs de structure “ergostane” ergostane 1. O3 2. DMS BRs Z. Li et al., Tet. Lett., 2003, 44, 3991. T.G. Back et al., Can. J. Chem., 1993, 71, 156. B.H. Hazra et al., Tetrahedron, 1994, 50(8), 2523. Nouvelle méthodologie

Travaux futurs BRs de structure “ergostane” Nouvelle méthodologie   BRs de structure “ergostane” Nouvelle méthodologie Notre hypothèse de travail 23 24 ou sans AL, borolane de Roush

Maria-Grazia Martinoli Remerciements   Martin Boisvert Fanny Longpré Maria-Grazia Martinoli Julie Carange Jennyfer Mercklé Pauline Dubromez  

Questions ?

Sélection Mallyl (état de transition non-cyclique)

Sélection Mallyl (état de transition cyclique)

Brassinostéroïdes 24 3 2 Squelettes des brassinostéroïdes cholestane

Brassinostéroïdes 24 3 2 Squelettes des brassinostéroïdes ergostane

Brassinostéroïdes 24 3 2 Squelettes des brassinostéroïdes stigmastane

Brassinostéroïdes Produits de départs ? Ergostérol (10g = 112$) Stigmastérol (R1=Et, R2=H) (10g = 277$) Crinostérol (R1=Me, R2=H) (pas commercial) Brassicastérol (R1=H, R2=Me) (5mg = 377$) Pregnénolone (25g = 120$)

Synthèses 4 3 4 A A Signal « large » car JHax-Hax ↑ (~ 180°) 22,9 Hz de largeur ppm cycle A 4 3 Signal « étroit » car les J ↓ (≠ 0 ou 180°) A 6,7 Hz de largeur ppm cycle A 4

Parkinson traitement au MPP+ MPDP+ MPTP MPP+ spontanée MAO-B Transformation du MPTP en MPP+ par cellules gliales qui le relâchent. MPP+ entre dans neurones par DAT. Cellules gliales (par exemple astrocytes et la microglie) = cellules immunité cerveau. MAO-B MPTP MPP+ 1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine 1-Méthyl-4-PhénylPyridinium Passe la barrière hématoencéphalique

Parkinson MPTP MPP+ Les cellules gliales transforment le MPTP en MPP+ MPP+ entre dans les neurones dopaminergiques par le DAT Une fois dans le neurone, MPP+ (via différents mécanismes) augmente la production de ROS (reactive oxygen species) et diminue la synthèse de l’ATP, donc perte de neurones dopaminergiques MPP+ inhibe complexe 1 chaine respiratoire mitonchondrie. MPTP MPP+ 1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine 1-Méthyl-4-PhénylPyridinium

Parkinson MPP+ inhibe complexe 1 chaine respiratoire mitonchondrie. Dauer et Al, Neuron, 2003, 39 ,1027-1046

Synthèses Pas encore testé Dihydroxylation ? NaBH4, EtOH Reflux, 8h (62%) pTsNHNH2, PTSA MeOH/CHCl3 Reflux, 4h30 (67%) Pas encore testé Dihydroxylation ?

Neuroprotection Effet du stigmastérol sur la toxicité du MPP+ dans les cellules PC12 neuronales.

Dihydroxylation Hydroquinidine 4-chlorobenzoate

Dihydroxylation

Dihydroxylation

Activité antioxydante des BRs

Activité antioxydante des BRs

Activité antioxydante des BRs

Brassica vegetables

Test LDH Réactif

Mitsunobu

Mitsunobu

Osmylation

Osmylation