Travail de génétique Analyse de l’expression des gènes mis en jeu lors de la phase aigue de l’inflammation en utilisant un modèle des régions codantes chez le chien Sophie Bitté Flora Bonnet Anne-Sophie Bouix Marthe Woygnet 2ème doctorat 2006-2007

PLAN I. Objectifs II. Matériel et méthodes III. Résultats et discussion IV. Conclusion V. Intérêts Bibliographie

Objectifs Similitudes entre chien et homme dans réponse face à des cas de toxicité de certains médic.humains. !!! Attention aux extrapolations d’infos erronées!!! lancement d’une étude sur le séquençage et l’expression du génome du chien identification de marqueurs biologiques compréhension des mécas d’action mis en jeu  importance capitale pour l’industrie pharmaceutique  Peu d’informations disponibles et coût élevé ( rongeurs)

Sonde contient des séquences canines et humaines Identification des mécanismes des marqueurs biologiques mis en jeu grâce à l’utilisation d’une sonde reconnaissant spécifiquement des régions codantes du génome canin. Sonde contient des séquences canines et humaines compréhension action moléculaire au niveau voies métaboliques, organes cibles, sites d’action face à un cas de toxicité. Séquences humaines: augmente capacité d’expression des séquences possibilités comparaison directe entre génomes humain et canin

Cette toxicité résulte de l’administration à des chiens de LPS, mimant ainsi une situation endotoxique. Choix de ce modèle en raison des similitudes à travers les espèces au niveau des marqueurs traditionnels de la phase aigue de la RI comparaison possible entre les profils de transcrits, formules sanguines, paramètres hématologiques du chien avec ceux d’autres espèces, et notamment de l’homme

Matériel et Méthodes Séquence codante canine • séquence d’oligonucléotides obtenue à partir du modèle de la séquence U133 humaine ( 12,8 mm) • 22 774 sites reconnus par la sonde dans la séquence construite →13 729 spécifiques au chien ( dont 10 079 issus du domaine privé et 3650 de la banque génétique publique) → 8945 sites de référence humaine • synthèse par photolithographie

Conception et sélection de la sonde •attribution score de qualité pour chaque sonde, basée sur l’efficacité de l’hybridation. •classification des sondes suivant divers paramètres

Animaux d’études • 9 beagles mâles de 8 à 25 mois, et de 5 à 11 kg. • période d’adaptation de 3 semaines • ration: 300 g le matin et eau à volonté • formation 3 groupes (contrôle, LPS 4h, LPS 24h) ~chiens traités: dose unique en IV de 0,2 mg/kg de LPS en solution saline ~chiens contrôles: injection de l’excipient uniquement • mise à jeun la nuit précédent l’injection, et 4h avant l’euthanasie • euthanasie des animaux 4h ( groupe 2), ou 24h (groupe 3) après l’administration de LPS

Evaluation des paramètres hématologiques et chimiques •collecte d’échantillons sanguins → tube avec EDTA: détermination du taux de réticulocytes, plaquettes, leucocytes… → tube avec citrate de sodium: détermination de prothrombine et thromboplastine, via une centrifugation pendant 10 min. à 3000 tours/min.

→ kits immunologique: détermination des concentrations de SAA et CMP → tube sans anti-coagulant: détermination des concentrations en glucose, cholestérol, triglycérides…, via une centrifugation; et détermination de l’activité de ALP, GGT, ALT, AST. → kits immunologique: détermination des concentrations de SAA et CMP •évaluations histopathologiques sur le foie, le cœur, les reins et les tissus du tractus gastro- intestinal

Préparation des échantillons •prélèvement de 150 mg de foie et homogénéisation dans 1 ml d’ARN stat.60 •extraction ARN total Purification ARN sur colonnes Mise en solution avec ARN canin Transcription inverse en double brin d’ADN •synthèse ARN puis fragmentation Hybridation avec la sonde canine

Méthodes d’amplification rapide d’une séquence d’ADN: PCR • utilisée pour confirmer la série de changements transcriptionnels observés lors de l’expérience. • utilisation d’amorces pour certains gènes spécifiques SAA , Il 8 , ND 5 , TIMP1 , SDF2L1 • suivi du protocole classique, 3 fois par prélèvement. Traitement ARN par ADNase et Transcription inverse Electrophorèse des produits obtenus Incubation des tubes à PCR pendant 2 min à 50°C Dénaturation des proteines à 95°C pendant 10 min Série d’incubations,± 50, à 95°C pdt 15 sec, puis 60° pdt 1 min

RESULTATS Paramètres performance de la séquence codante signal d’intensité total détermination du gène « présent » ou « absent » calculés par algorithmes standard affymetrix résumés pour le profil de transcription d’un échantillon de foie de chien (n = 4)

Sondages provenant de séquences de chien = expression en moyenne + grande que sondages provenant séquences humaines Tt signal d’intensité = déterminant majeur appelé dans l’attribution des gènes de détection 1 augmentation des valeurs d’intensités + de gènes dérivés du chien = appelés « présent » 28% sondages spécifiques au chien = « présent » 8% de ceux humains

Autres expériences : pour voir si stratégie : Signal d’intensité sondes dérivées canine>homme MAIS dépend région codante =analysée Autres expériences : pour voir si stratégie : séquences dérivées de l’homme dans modèle de séquences codante canines améliore l’hybridation à travers les espèces Déterminer si source de faible intensité du signal humain = - faible réaction inter espèce ou - d’efficacité échantillons identiques foie CN hybridés séquentiellement pour les modèles de séquences codants pour les chiens et l’homme U133A

Sur les 8945 RefSeq dérivés séquentiels de la sonde humaine sur les modèle de séquences codants chez le chien : 965 transcriptions « présentes » sur au – 1type de modèle de séquences codante sur échantillon de foie Sur ces 965 -> 10% « présents » sur les 2 types de modèle 32% uniquement CN 58% uniquement homme U133A Haut % gènes détectés exclusivement sur base 3’de la sonde du modèle U133A suggère : La localisation de la sonde = facteur important dans la détection des nucléotides du modèle

Différentes expressions des gènes en réponses aux LPS Test de l’aptitude du modèle de la séquence codante canine a détecter l’expression des différents gènes CN Beagle ♂ traités doses non létales d’endotoxines bactériennes mesure expression gène hépatique à 4H et 24H après l’administration de LPS

Nombre de transcription détectée = pas variable entre les 2 gpes Mais gènes régulés négativement = 4h > 8h Evaluer l’intensité de la réponse inflammatoire : Observations clinique Composition sérique Paramètres hématologiques et histopathologiques corrélation avec données de l’expression génique obtenue par modèle séquence codante canine

Observations cliniques concordent avec l’évolution d’1 endotoxémie : activité et vomissement prise nourriture ( 24H) Effets hématologiques du médiateur LPS mesuré : Leucocyte à 2 et 4h mais à 24h Neutropénie modérée à 2 et 4h Neutrophilie modérée à 24h Légère prolongation activité partielle thromboplastine et prothrombine minime réticulocyte 2 h après administration

Changements morphologiques : congestion nécrose vacuolisation des cellules hépatiques Dans littérature, administration LPS cause: Changements majeurs niveau marqueurs chimiques de réponse aigue de l’inflammation [CRP] de 4 à 24h Activité ALT et AST relativement disponibilité séquences ADN des marqueurs SAA, ALP, Albumine et AST ont permis comparaison changements chimiques avec donnée expression géniques des séquences codantes

Détermination sériques de ces 4 protéines [SAA] pendant 2h après administration LPS + continue toute la période d’étude ARNm SAA = suractivé dans foie à 4 et 24h transcription induite + de 100 * dans gpes 4 et 24h activité ALP tout au long de l’étude expression ARNm ALP à 4 et 24h [albumine sérique] de 15% (point 24h) niveau transcrition ambumine de 4 * à 24h Activité sérique AST gpe 4h après administation transcription hépatique séquence AST de 2* à 4 et 24h

PCR RT pour SAA, IL-8, TIMP1, NDS et SDF2L1 Différents gènes exprimés sont choisis pour confirmation par PCR en temps réel PCR RT pour SAA, IL-8, TIMP1, NDS et SDF2L1 confirmation résultats des modèles des régions codantes induction SAA confirmée : gpe 4 et 24h rapide et brute induction IL-8 et TIMP1 confirmée par PCR Activité de régulation de ND5 détectée par sondes et PCR SDF2L1 transcrit avec faible intensité corrélé avec résultats modèle de séquences codantes, PCR confirme : primeur pour homme SDF2L1< pour l’amplification que primeur du chien

Expression gènes combinés = exprimés tôt Corrélation biologique et implication des résultats aux mesures transcriptionnelles Expression gènes combinés = exprimés tôt + tard = réponses transcriptionelles aux endotoxines des bactéries Induction importante dans la transcription codant les cytokines et d’autres médiateurs de l’inflammation = s’observe 4h post admi LPS IL-6 induit+++ à 4h puis basal à 24h IL-8 transcription à 4h, 20*> au gpe contrôle

rapide et marquée transcription remodelage matrice extracellulaire tel TIMP1 temps dépendante de protéines additionnelles de la matrice extracellulaire comme Elafine et IHRP taux de glucose plasmatique sous régulation transcriptions impliquées dans la régulation de glucose ( surtt 24h) Ex gènes répressés : UDP gluc phosphorylase transporteur glucose type5 phosphoglucomutase

Famille cytP450 = sous régulés à 24h Changement de transcription similaires dans la phase 2 de la biotransformation enzymatique (incluant plusieurs GST et UDP glucuro) taux cholestérols et triglycérides à 8 et 24h massive expression gène codant pour enzymes impliquées dans métobo cholestérols observé à 24h Ex : ACAT, LCAT, CYP7A 7*à 24h mais pas à 4h

DISCUSSION Implication des réponses transcrites mesurées : Modifications au niveau de la matrice extra cellulaire: ● TIMP1 : augmente 4h et 24h post administration LPS ● MMP9 : augmente 24h post administration LPS Contrôle du remodelage de la MEC via équilibre entre le taux de métalloprotéinases activées et le taux de TIMPs. ( formation de complexes irréversibles ) ● ETAFIN : augmente post administration LPS inhibiteur sérique du gène de la famille des Troppines Contrôle protéolyse MEC via l’inhibition de l’elastase

● IHRP : protéine de l’inflammation augmente post administration LPS ( expression du gène IHPR inductible par LPS ) L’ activité des enzymes extra-cellulaires des chiens traités au LPS serait donc liée au contrôle de la protéolyse des constituants de la MEC et préserverait ainsi l’intégrité des tissus. NB: Une autre hypothèse explicative serait une inhibition directe des enzymes extra-cellulaires. TIMP1,ELAFIN et IHRP: marqueurs non invasifs de la phase aigue de la réponse inflammatoire ( dans sang et ARNm ).

Modification au niveau des médiateurs de l’inflammation: Chez l’homme : 1- phase symptomatique à 4 h 2- phase asymptomatique à 24 h Chez le chien: 1- inflammation précoce 2- modifications voies métaboliques plus tardivement Dans la littérature: Les LPS induisent une situation d’endotoxémie responsable d’ une augmentation de l’expression des médiateurs de l’inflammation.

Détection de l’induction de cytokines pro inflammatoires comme : IL 6 , IL 8 , TNF alpha capables d’activer des voies de signalements intra-cellulaires ainsi que d’activer des facteurs de transcription impliqués dans l’activation de gènes codant pr des molécules inflammatoires Modifications au niveau du métabolisme des lipides: Suite à l’administration de LPS: perturbation du métabolisme lipidique au niveau du foie Diminution expression de gènes codant pr enzymes responsables du catabolisme du cholestérol et des triglycérides explique l’augmentation tardive des taux sériques de cholestérol et TG

Modification au niveau du enzymes de la biotransformation: • diminution expression et activité de certaines isoenzymes hépatiques lors phase aigue de l’inflammation • observations en accord avec le fait que l’expression de certaines enzymes de la biotransformation diminue fortement suite administration de LPS Ex: niveau de transcription de CYP2D15 fortement à 24h post LPS diminution expression d’enzymes de la détoxification

Identification de nouveaux biomarqueurs de la phase aigue de l’inflammation: • activation du transcrit Sec61a: translocase de protéines impliquées dans la sécrétion protéique ( augmente à 4 h et à 24 h ) Sec 61 serait impliquée dans sécrétion des prot. de la phase aigue de l’inflam., synthétisées dans les hépatocytes et transportées dans le sang. La machinerie de translocation des prot. pourrait etre sensible à la [ ]° en cholestérol dans membrane du RE. • SDF2L1: prot. sécrétoires fonctionnant comme enzymes O-glycosylantes dans levures. Lien entre phase aigue inflammation et état de glycosylation des protéines circulantes.

CONCLUSION Nombreux changements ( connus ou non ) au niveau de la transcription, dans le foie lors phase aigue inflam. Confirmation de ces résultats via paramètres comme: biochimie, hématologie, histopathologie et analyses PCR Génétique moléculaire: outil génial pour mieux comprendre les «  mystères » des mécanismes inflammatoires. + découverte de nouveaux marqueurs de toxicité ainsi que de nouveaux gènes mis en jeu lors RI.

!!! Ne pas abuser des chiens comme animaux de laboratoire !!! INTERETS • pour développement industrie pharmaceutique en médecine humaine: tests des effets moléculaires chez le chien permettent meilleure prévision des effets chez l’homme évaluation toxicité éventuelle des médicaments • à l’inverse, exploitation résultats obtenus chez l’homme à des fins thérapeutiques chez le chien. renforcement panel médical VT !!! Ne pas abuser des chiens comme animaux de laboratoire !!!

BIBLIOGRAPHIE Higgins, M.A. Berridge,B.R. Mills,B.J. Schultze,A.E. Gao, H. Searfoss,G.H. Baker,T.K.and Ryan,T.P (2003). Gene expression analysis of the acute phase response using a canine microarray Griffiths. Gelbart. Miller.Lewortin.(2001)Analyse génétique moderne. DeBoeck Université