Le 24 Novembre 2011 Cours de chromatographie d’exclusion Professeur SAALAOUI Ennouamane

CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION TAMISSAGE MOLECULAIRE FILTRATION TAMISSAGE MOLECULAIRE Chromatographie par perméation de gel Chromatographie dexclusion -diffusion Chromatographie dexclusion –de taille généralement Chromatographie d’exclusion stérique Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Chimie macromoléculaire Perméation de gel Chimie macromoléculaire Phase mobile est de nature organique Filtration sur gel Biopolymères commeprotèines La phase mobile est aqueuse Chromato d’exclusion de taille Silices greffées et non des gels Chaînes poly-2hydroxyméthyl aspartamide Bcp de NH2 , OH , CO caractère hydrophile Liaisons hydrogènes crée des ponts des chaînes polyaspartamide Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Le principe de la chromatographie d’exclusion Le tamissage moléculaire (pores) Séparation en fonction de la taille -Le chemin parcouru par les molécules dépend de leur taille Les plus grandes s’excluent Les plus petites s’inclusent Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

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Le choix en fct de la taille des molécules à séparer liaison a1-6 et 1-4 dextrane (polymères de glucose) des ponts 1959 Branchement + Réseau + ou - serré Séphadex G10, G15, G200 Degré de réticulation décroissant Mailes + en+ grandes Le choix en fct de la taille des molécules à séparer Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Principe de l’exclusion VP VS Vo Vo= Vm Vi= Vp Vs = VG VT = Vo + Vp + Vs Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Différents volumes sur le chromatogramme VP VS Vo Vo = volume mort = Vm Vp = volume des pores Vs = volume interne =Vg Vo Vp Vs Vc Vo VR VT Vc = Vo + VP + VS VT = Vo + VP Volume de la colonne Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Volume de diffusion totale VC = Vo + VP + VS VT = Vo + VP VS est négligeable VT = Vc f = fraction des pores VR = Vo + VP f . K . 1-0 f=0 log PM VR Vo VP Ou Ve Si K=1 molécules diffusent bien VR = Vo + VP f . 0 f 1 Si f=0 molécules totalement exclues VR = Vo f=1 Si f=1 molécules incluses VR = Vo + VP Volume de diffusion totale Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Cas des substance aromatiques avec les gels de dextarn Si K 1 ceci signifie VR = Vo + VP f . K . VR VT forte inclusion D’autres phénomènes que l’exclusion Adsorption ou Échange ionique Cas des substance aromatiques avec les gels de dextarn Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

VR = Vo + VP f . K . Si K= O Molécules complètement exclues K .f (Vo-VR(= Vp Available accessible Kav = VR-VO Vp + VG VT = Vo + VP + VG VP + VG= VT - Vo Kav = Vp Vp + VG = Kav Vo-VR VT – Vo Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Efficacité de la colonne 1 2 a = TR2 – To Rs = ¼ (a-1)/a . k2/(1+k2). N21/2 Efficacité de la colonne Influence de la capacité La résolution To – 1TR La sélectivité Rétention relative Distribution 2 S -porosité du gel -taille des S -uniformité des f des pores La sélectivité Rétention relative Distribut° des 2 S -porosité du gel -taille des S -uniformité des f des pores Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

f=0 log PM Exclusion Domaine exploré Diffusion totale Inclusion f=1 k = K . Vs/VM Vs = f. Vp En chromato d’exclusion le K est tj voisin de 1 ; k entre 0,5 et 3 k = Vs/VM Vs volume des pores accessibles VM volume extragranulaire Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Rs = ¼ (a-1)/a . k2/(1+k2). N21/2 Le R augmente en même temps que k Au delà de 5 à 10, la résolution ne varie pas H = L/N N = 16 (TR/ w)2 Vo Vp Vs w Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Aspects pratiques Sur couche mince colonne Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Caractéristiques des Phase stat Le f des pores (réticulation?) La taille et la forme des particules Petites Sphériques Granulométrie variable L’inertie L’affinité des gels pour les solutés La consistance classique micomiètre 120 - micomiètre 40 micomiètre 80 - micomiètre 20 H performance Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Substrat du gel (phase dispersée) La phase dispersante le solvant Différents supports La phase stationnaire Substrat du gel (phase dispersée) La phase dispersante le solvant Grains, bille ou perle calibrées différents polymères dextrane polyacrylamide agarose Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Classification des gel d’exclusion Xérogels : - mous - semi rigides Dextran ; agarose ; polyacrylamide; poly-; polyvinyl; styrènes séphadex Sepharose BiogelA ultrogel Séphacryl Biogel ultrogel Styragel biobeads fractogel aérogels rigides Perles de verre Ou silice poreuse ne gonflent pas Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

Caractéristiques du gel Colonnes de dessalages de solutions protéiques, prêtes à l'emploi, rapides et économiques. En 3-4 minutes, les sels et molécules de poids moléculaire < 5 kDa sont éliminés Caractéristiques du gel 􀂝 Polymère poreux hydrophile : réduction au maximum des adsorptions non spécifiques 􀂝 Stabilité mécanique élevée : résistance à des pressions jusqu’à 7 bars 􀂝 Stable aux pH de 0 à 14 􀂝 Pas de rétraction ni de dilatation des billes quel que soit le tampon des colonnes TSK-Gel de chromatographie d’exclusion de tailles, aussi bien pour la GFC (Gel Filtration Chromatography) séparation de peptides, protéines et autres molécules solubles en milieux aqueux que pour la GPC (Gel Perméation Chromatography) séparation de polymères solubles en milieux organiques. Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012