Principes et applications TECHNIQUES Principes et applications

Culture de Tetrahymena Données de base Température optimale: 28 °C Température minimale: environ 12-14 °C Température maximale: environ 31-32 °C (choc thermique réversible) Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h)

Culture de Tetrahymena Milieux de culture Culture axénique: sans autres micro-organismes Milieu semi-défini Source acides aminés: hydrolysat de protéine Protéose, peptone, tryptone, lait Source de vitamines: extrait de levure Glucose Sels: peu concentrés, maintien du pH Na ou K, H2PO32-

Culture de Tetrahymena Culture stock Température basse: 14°C Milieu pauvre Pas de source de vitamines ou glucose Peptone peu concentrée => Doit utiliser beaucoup d’énergie/temps pour synthétiser vitamines et autres Croissance lente Repiquage moins fréquent

Culture de Tetrahymena Culture de conditionnement Température presque optimale: 25°C Milieu riche source de vitamines ou glucose hydrolysats plus concentrées et variés Réadaptation progressive à des conditions de croissance rapide

Culture de Tetrahymena Culture de croissance Température optimale: 28°C Milieu riche source de vitamines ou glucose hydrolysats plus concentrées et variés Agitation: meilleure oxygénation Conditions de croissance rapide Obtention de grandes quantités de cellules

Culture de Tetrahymena Culture massive Température optimale: 28°C Milieu très riche source de vitamines et glucose lait comme source d'acides aminés Agitation: meilleure oxygénation Conditions de croissance rapide Obtention de très grandes quantités de cellules

Culture de Tetrahymena Culture en milieu défini Milieu défini: [ ] exactes de toutes les composantes individuelles sont connues Température optimale: 28°C Milieu Acides aminés Vitamines Glucose Autres éléments (ac. gras, minéraux….) => Connaissance et contrôle des conditions

Culture de Tetrahymena Milieu minimal Tris 10 mM + pH 7.6 + Glucose Milieu simple pour incorporation acides aminés marqués Pas de croissance Court terme "choc" => induisant une réponse ????

Tetrahymena Concentration des cellules Dispositif de concentration Certaines manipulations requièrent des concentrations de cellules non obtenues par des cultures de croissance Si on a besoin de concentrer les cellules

Tetrahymena Concentration des cellules Lang et Gauthier (1993)

Tetrahymena Enumération à l'hémacymètre Détermination du nombre de cellules Hémacymètre Normalement destiné à l'énumération des cellules du sang 2 cotés et 5 zones par coté 10 zones = 1 µL Lamelle spéciale (coûteuse) Cellules immobilisées (formaldéhyde) Cellules cotés: supérieurs et gauches

http://www. bdbiosciences http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtools/hemarefpf.html

Tetrahymena Traitements Exposition à choc thermique ou toxique Cellules concentrées/diluées pour obtenir conc. finale voulue Tubes contenant le milieu de culture (selon volume final voulu) toxique concentré --> conc. finale voulue au temps = 0 cellules concentrées --> conc. finale voulue N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube 1 tube sans produit toxique: solvant du toxique

Traitements Incuber à T° voulue Prélever aliquotes aux temps voulus --> µtubes (1.5 ou 2 mL) Centrifuger > 10 kRPM x 10 min --> sédiment = cell. Extraire les cell. en resuspendant dans soln voulue SDS --> électro.

Electrophorèse (EGPA) Séparation des protéines par EGPA-SDS Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage Charge uniforme + géométrie similaire séparation selon masse Système triphasique Tampon d'électrode: glycine Gel de tassement: Cl- pH 6.8 (conc. PA faible) Gel de séparation: Cl- pH8.8 (conc. PA forte) ==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour donner une résolution supérieure

Electrophorese Principe de la séparation

Electrophorèse Analyse des protéines synthétisées Tassement Séparation Fixation et Coloration Ac. Acétique 10% Bleu de Comassie (simple et sensible) Argent (complexe mais très sensible) Buvardage ou Séchage + conservation

Buvardage principes Transférer à la surface d'une matrice solide Différentes matrices: nitrocellulose… PVDF, nylon. Capacité d'adsorption Buvardage: transfert électrophorétique Adsorption: forces hydrophobes, ioniques Méthanol. porosité de la matrice, durée et puissance du transfert

Transfert western mécanisme

Immunodétection Identification et détection d'une protéine spécifique Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice Buvardage électrophorétique Application directe ("dot blot")

Immunodétection précautions Blocage des sites inoccupés Protéines: lait en poudre, albumine, collagene (gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps, enzyme indicateur Prévention des liaisons non spécifiques détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et Ab-marice non spécifique)

Immunodétection Adsorption de l'anticorps sur l'antigène (primaire) Adsorption de l'anticorps secondaire conjugué avec enzyme sur l'antigène primaire (autres marqueurs fluorochromes) Détection de l'enzyme: Chromogénique Chemiluminescent Radioactif, fluorescent, etc.

Immunodétection: enzymes Phosphatase alcaline Sensible Bon contraste en photo Stable Peroxydase de raifort (HRP) Assez sensible Durée limitée incubation (H2O2) Coloration +/- stable (H2O2) Contraste moyen

Electro ou Immunodétection Comparer des patrons de migration Déposer même quantité de protéines ou protéines provenant d'une même quantité de cellules = difficile Base de comparaison: étalon interne Protéine qui reste en quantité stable dans une cellule Étalons courants: actine, GAP

Immunodétection

Marquage métabolique des protéines Souvent on doit être capable de distinguer les protéines dont la synthèse est induite/ralentie par le traitement => Marquage métabolique: Exposition des cellules a des ac. Aminés marqués Extraction et séparation des protéines Autoradio- ou fluorographie