« Bases moléculaires de la réponse aux xénobiotiques» Laboratoire « Bases moléculaires de la réponse aux xénobiotiques» Bahïa EL ABED, 3ème1 du 12 au 16 décembre 2011

Sommaire Présentation de l’entreprise Fonctionnement de l’entreprise Culture de cellules Compte-rendu hebdomadaire Description des tâches accomplies Conclusion

Présentation de l’entreprise Suivant U – 775 INSERM est un laboratoire public où l’on réalise des recherches scientifiques pour étudier différents sujets de recherche: le cancer du colon, du poumon, la transplantation rénale ( = du rein) , le métabolisme au niveau du foie et les xénobiotiques… Ce laboratoire se situe dans l’université Paris 5 au Centre universitaire des Saints-pères, dans la rue portant le même nom au 6ème arrondissement, à Paris.

( ICI ) Traduction des abréviations Fonctionnement de l’entreprise ( ICI ) Traduction des abréviations Suivant

Culture de cellules rénales adhérentes Suite Les machines utilisées: -Hotte chimique, incubateur, bain marie, centrifugeuse, microscope Le matériel utilisé: - gant/blouse, milieu de culture spécifique pour les cellules ,des flasques / plaque 6 ou 12 puits, pipette, cellule de Malassez La formation requise: Plusieurs conditions possibles: BTS en analyse biologique ou FAC biologie/biochimie Flasques Plaque 6 puits Plaque 12 puits La culture de cellule est un procédé qui a pour but de changer le milieu de culture des cellules (= là où elles grandissent et se nourrissent à la fois).

Réalisation d’une culture de cellules (suite) Suivant 1- décongeler les cellules 2- centrifuger 3- enlever le milieu de culture et en mettre un propre 4- on met les cellules ainsi que le milieu dans la flasque 5- on laisse les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures 6- ensuite, on change de nouveau de milieu de culture 7- on laisse les cellules dans l’incubateur, pendant 72 heures cette fois 8- (les cellules se sont multipliées) on décolle les cellules qui, comme elles sont adhérentes, se sont accrochées à la paroi de la flasque Pour finir, on peut compter le nombre de cellule que l’on a avec la technique de la cellule de Malassez. Cellules cultivées en laboratoire U775 INSERM, vues au microscope

Compte rendu hebdomadaire Suivant Lundi Mardi Mercredi Jeudi Vendredi Matin Visite du laboratoire début de la manipulation Western Blot - Poursuite de la manipulation Poursuite de la manipulation Utilisation de la salle utilisant une technique d’immunofluorescence (plus d’’informations dans la description des tâches accomplies) Utilisation de la chambre noire pour achever la manipulation - Autre manipulation pour vérifier si le Western Blot a marché - Nouvelle manipulation: reverse transcription Après-midi - Observation de cellules cultivées - Observation d’une manipulation effectuée sur des tissus de cerveau

Description des tâches accomplies Suivant Immunofluorescence  Nous avons cherché à détecter dans des cellules cultivées dans une plaque 12 puits des colocalisations de protéines différentes ( LC3B et CMHII). Le résultat a eut lieu dans une salle avec un microscope à épifluorescence et le logiciel « NIS element ». Nous avons aperçu des points oranges suite au mélange de deux protéines colorées. (voir si dessous) Mesure de la viabilité cellulaire  Nous comptons, dans l’ensemble de cellules cultivées, le nombre de cellules mortes et vivantes, à l ’aide d’une lame contenant la cellule de Malassez, d’un microscope, d’un compteur manuel, et d’un colorant « bleu trypan » qui met en bleu les cellules mortes. Western Blot  nous avons cherché à voir les variations d’une protéine en fonction des produits qu’on lui a administré. Le résultat a eut lieu dans une chambre noire, dans le même type que lorsqu’on développe des photos: c’est la chimiofluorescence.

Conclusion J’ai beaucoup apprécié cette semaine d’immersion dans le monde du travail, il m’a permis de cerner un peu mieux ce qui m’attend plus tard à l’aboutissement de mes études. J’ai beaucoup aimé la façon dont les chercheurs travaillent, car ils n’ont pas d’horaires strictes et font des manipulations sur ce qu’ils souhaitent. Cela a eut une forte influence sur mon projet personnel car je concevais le monde scientifique comme quelque chose d’ennuyant à la longue. Mais c’était le contraire, j’apprenais beaucoup de choses et m’intriguais sur tout ce qui n’était pas « mathématiquement » correct. Je commençais à réfléchir comme un chercheur ! J’ai aussi beaucoup appris du côté de la manipulation, j’étais souvent chargée de doser les pipettes (ces dernières étant beaucoup plus élaborées que celles qu’on utilise généralement qui sont en plastique mou). Je conseillerais à un futur stagiaire de ne pas s’inquiéter s’il ne sait pas du tout ce qu’il voudra faire plus tard, comme moi je me suis inquiétée, car le stage ouvre vraiment les yeux sur les directions d’étude que l’on peut prendre ! Sigle des risques biologiques 

Annexe Cellule de Malassez : c’est un grillage qui permet de mesurer la viabilité cellulaire, qu’on insère dans un microscope. Les cellules mortes sont colorées avec le bleu trypan (un colorant), ce qui leur donne une teinte bleue facilement reconnaissable. Les cellules vivantes sont généralement grises. On réalise le compte uniquement dans les rectangles subdivisés en 20 petits carrés. Hotte chimique : surface de travail stérile permettant de manipuler des cellules sans qu’elles aient contact avec l’air (non stérile) de l’extérieur. L’incubateur : ressemblant à un mini-frigo, il permet de mettre les cellules dans un environnement parfait pour eux : maintenu à 37 degrés. Milieu de culture : c’est une substance généralement dans les tons roses-rouges qui nourri les cellules.

Lexique Traduction des abréviations: A.I : Assistant ingénieur ATE : Attaché temporaire d’enseignement C.P : Chargé de Projet C.R : Chargé de Recherche D : Doctorant M2 : Master 2 M.C.U : Maître Conférence Universitaire Post. D: Post Doctorant (Post = Après) P.U : Professeur universitaire P.H : Praticien (= Médecin) Hospitalier Xénobiotiques: Substance étrangère à l’organisme Métabolisme: Transformation d’un produit (ici molécule) en un autre produit (ici molécule). Colocalisation: C’est lorsque que deux protéines sont collées ensembles dans une cellule et donc qu’elles fonctionnent ensemble. Microscope à épifluorescence: C’est un microscope qui fonctionne à l’aide de laser et qui permet de voir des minuscules molécules fluorescentes.